微生物在农药污染治理中的应用

微生物在农药污染治理中的应用

中国是农业和畜牧业的主要国家之一。每年使用的农药量为50.60万吨。这种植物包括草屑素、杀菌剂、杀菌剂和其他农业化学品。农药的利用效率很低,其中约80%的农药直接进入环境。由于长期、大量和不合理的使用,农药在发挥其保障作物产量巨大功效的同时,也对环境造成了污染,严重影响食品安全和人们的身体健康。在农药污染治理方面,微生物因其种类丰富、分布广泛、适应性强和代谢途径多样的特点逐渐显现出自身的优势。围绕着农药降解性微生物资源、代谢机制及农药残留污染修复,本课题组进行了大量的研究工作,形成系统的农药残留微生物修复技术体系,获得国家科学技术进步奖二等奖(2005-J-201-2-03-D01)。在南京农业大学110周年校庆之际,笔者将近10年来在农药残留微生物降解方面的工作进行综述以志纪念。1降解性微生物资源高效降解性微生物是农药残留微生物修复技术的核心,获得有用的农药微生物降解资源在农药污染治理方面显得格外重要。由于农药的种类繁多,而微生物的降解一般具有特异性,因此需要针对不同的农药品种进行降解性微生物的分离筛选。近10年来,本实验室围绕农业生产中常用的除草剂、杀虫剂、杀菌剂及其他有机污染物,筛选获得大量的降解性微生物资源(表1),并建立较为全面的降解性微生物菌种资源库。从降解的目标化合物的角度分析,有机磷杀虫剂、菊酯类杀虫剂、磺酰脲类除草剂、对硝基苯酚降解菌资源较为丰富(图1)。从降解性微生物的分类地位看,在这些降解菌中,Pseudomonassp.占到了高达30%的比例,Sphingomonassp.和Paracoccussp.被分离到的机会也较多(图2)。大量的高效降解性微生物资源为污染物的微生物代谢机制研究及污染土壤的微生物修复提供了重要的菌种资源。在降解性微生物资源的分离过程中获得了多株微生物的新菌种,如FlavobacteriumhaoraniiLQY-7、SphingobiumwenxiniaeJZ-1、SphingobiumfaniaeJZ-2、Rhodococcusjialingiaedjl-6-2、LysobacterruisheniiCTN-1、SphingobiumqiguoniiX23,分别用我国著名的微生物学家及土壤学家简浩然、陈文新、樊庆笙、王家玲、焦瑞身和赵其国的名字进行了命名。这些新微生物资源的分离为探索微生物多样性提供了重要的材料。2降解酶基因检测在微生物降解农药的代谢途径中一般有多种降解酶的参与,对编码这些降解酶的基因进行克隆分析可以帮助阐明微生物对农药的代谢机制。本课题组从多株降解性微生物中克隆到一系列的降解酶基因,包括甲基对硫磷水解酶基因mpd、磺酰脲类除草剂水解酯酶基因sulE、六六六降解基因簇lin、酰胺类除草剂水解酶基因ampA、菊酯类农药水解酶基因pytH及对硝基苯酚降解基因簇pnp。在降解酶基因克隆过程中,发展了一种新的染色体步移方法SEFAPCR(self-formedadaptorPCR),可以高效地克隆目标序列两侧的未知序列。2.1水生动物联络导导的pcr扩增在克隆降解酶编码基因的过程中,常常需要对菌株进行适当的遗传操作,从保守或已知序列进行染色体步移是经常采用的方法。Self-formedadaptorPCR(SEFAPCR)是Wang等建立的由已知序列扩增未知序列的一种PCR技术。SEFAPCR是基因组步行PCR设计思想的延伸,集连接介导PCR的高特异性和TAILPCR技术的简单性于一身。SEFAPCR在扩增中总共用到了4条引物。Sp1、Sp2和Sp4是根据已知序列设计的特异性高退火(如70℃)的引物。Sp3是一条能够与已知序列部分退火配对的特殊引物,是整个SEFAPCR的关键所在。采用SEFAPCR成功地扩增了多种植物、真菌、细菌已知序列的侧翼序列,特别是该PCR扩增过程具有较高的特异性,且扩增的目的条带比较长。管莉菠等利用该方法成功地克隆出了PseudomonasputidaGM6菌株的多聚磷酸盐激酶基因ppk,并对该基因的表达情况进行了研究。李娜等和何健等分别以总DNA为模板,利用该PCR方法克隆了灵芝鲨烯合酶基因的启动子序列和中度嗜盐菌Halomonassp.BYS-1四氢嘧啶合成基因(ectABC)及其上游序列。由于基因组步移技术在遗传操作中的重要性,因此SEFAPCR在侧翼序列克隆领域将会得到更加广泛的利用。2.2pnp基因序列分析崔中利等分离到了1株甲基对硫磷降解菌Plesiomonassp.M6,该菌具有有机磷水解酶活性,可水解甲基对硫磷产生对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP),这与Rani等研究的甲基对硫磷降解途径一致,但M6却不能将对硝基苯酚进一步降解。通过鸟枪法从菌株M6基因组文库中筛选到该水解酶基因,并将其命名为mpd。该基因与已报道的编码甲基对硫磷水解酶的基因opd完全不同,序列比对结果也表明,mpd基因序列与opd基因无同源性。PseudomonasputidaDLL-E4可以进一步降解甲基对硫磷分解产生的PNP。Shen等通过SEFAPCR扩增DLL-E41,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶(PnpC)基因的侧翼序列,获得12kb的DNA片段。序列分析发现该片段中含有10个参与对硝基苯酚代谢的开放阅读框架(图3),并将其命名为pnp基因簇。在该基因簇中,pnpA编码的是一个依赖FAD和NADH的单组分对硝基苯酚4-单加氧酶PnpA,在NADH和FAD存在的情况下,将对硝基苯酚转化为对苯醌(p-benzoquinone)。pnpC编码的是1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶,可将1,2,4-苯三酚转化为马来酰乙酸。pnpC1C2编码的PnpC1C2是对苯二酚(HQ)双加氧酶(PnpC1C2)多组分蛋白复合体,催化对苯二酚生成4-羟基黏糠酸半醛。pnpR是lysR家族调节基因,在pnp基因簇中,pnpR是一个参与对苯二酚降解的正向调控子。刘卫东对1,2,4-苯三酚(BT)1,2-双加氧酶(PnpC)的晶体结构进行了深入研究。发现PnpC由6个较长α螺旋和7个β折叠及转角组成。氨基酸截短试验说明,PnpCN端起始的3个α螺旋区对PnpC的酶活力是必需的。2.3不同结构的创新基因磺酰脲类除草剂是一类超高效除草剂,使用量低,但其残留造成的危害较为严重。Hang等研究了HansschlegeliazhihuaiaeS113对磺酰脲类除草剂的降解,发现这一家族的除草剂可以通过去酯化转化成无除草活性的相应的酸,这与Lu等的研究结果一致,并从S113中克隆到了1个与磺酰脲类除草剂去酯化代谢有关的酯酶基因sulE。通过对SulE基因测序及其表达蛋白SulE氨基酸序列分析发现,该基因含有1194个碱基,G+C摩尔分数为51.09%,编码398个氨基酸。SulE含有信号肽序列,切割位点在第37位的Ala和第38位的Glu之间,SulE是一个同源二聚体,每个亚基相对分子质量为41×103,等电点(pI)为8.3。SulE含有α/β水解酶的保守结构域,属于α/β水解酶超家族。SulE具有α/β水解酶家族蛋白典型三联体催化活性位点SerHis-Glu(Ser245、His369和Glu28);但是在催化位点的Ser周围没有该家族特征序列(Gly-X1-Ser-X2-Gly);因此,初步确定SulE是α/β水解酶家族的一个新成员。氯乙酰胺类除草剂是目前除草剂中用量排行第3的除草剂,其主力品种包括乙草胺、丁草胺等,其微生物降解也受到关注。Paracoccus属的微生物对酰胺类除草剂具有较好的降解能力。Zhang等从Paracoccussp.FLN-7中克隆到1个编码酰胺水解酶的基因ampA。AmpA可以水解酰胺类除草剂敌稗,并可以作用于多种酰胺类化合物及含酰胺键的有机磷农药。该酶的氨基酸序列与已知酰胺酶的一致性较低(小于22%),但其活性中心的结构却与其他酰胺酶一样是保守的(Ser154-Ser178-Lys79)。AmpA结构特性及其广泛的底物范围使得它在转基因抗除草剂植物育种方面具有巨大的应用潜力。2.4lin2结构及功能基因的扩增马爱芝等从长期受六六六污染的土壤中分离得到1株能以HCH为唯一碳源的高效降解菌株Sphingomonassp.BHC-A。BHC-A菌株在12h以内能够完全矿化质量浓度均为5mg·L-1的α-、β-、γ-、δ-HCH4种异构体,特别是对β-HCH的降解在国际上也属少例。Wu等以菌株Sphingomonassp.BHC-A为材料,通过Tn5转座子插入突变法,筛选到1株完全丧失β-HCH降解功能的菌株。通过构建BHC-A45的基因组文库,筛选到1株含有Tn5转座子序列的阳性克隆,对阳性克隆的转座子侧翼进行测序,发现了1个卤代烷烃脱卤酶基因linB2。与S.paucimobilisUT26脱卤酶LinB一样,LinB2可将β-HCH转化为β-2,3,4,5,6-五氯环己醇(β-PCHL),不同的是,LinB2还可将β-PCHL继续降解为β-2,3,5,6-四氯1,4-环己二醇(β-TDOL)。LinB是一个α/β水解酶家族中的氯代烷烃脱氯酶,与来源于XanthobacterautotrophicusGJ10的卤代烷烃脱卤酶(DhlA)、Moraxellasp.B的卤代乙酸脱卤酶(DehH1)及Pseudomonassp.CF600的2-羟基黏糠酸半醛水解酶(DmpD)具有显著相似性。BLAST比对结果显示,LinB2的氨基酸序列与S.japonicumUT26LinB具有97%的同源性。LinB2结构预测分析结果表明,在类似连接酶区域具有与LinB相同的催化位点(Asp-108、His-272和Glu-132);同时还发现,在LinB和LinB2的相同氨基酸位点处有7个氨基酸残基不同。在LinB中为Ala-81、Ala-112、Ile-134、Ala-135、Ile-138、Ala-247和Met-253,而在LinB2中为Thr-81、Val-112、Val-134、Thr-135、Leu-138、His-247和Ile-253。通过对这7个氨基酸中的每个氨基酸进行定点突变分析,结果表明每个氨基酸的改变都会明显减弱LinB2β-HCH和β-PCHL降解活性,氨基酸突变数目越多,减弱效果越明显,而当这个7个氨基酸完全突变时,LinB2已经完全丧失了β-HCH和β-PCHL降解活性;因此,推测这7个氨基酸残基差异可能是导致LinB无LinB2β-PCHL降解活性的原因。2.5ctn水降解氯酶Liang等从长期施用百菌清的土壤中分离到1株高效降解百菌清的Ochrobactrumsp.CTN-11,该菌可在无其他碳源的情况下,48h内可将50mg·L-1的百菌清完全降解。与以前报道的百菌清高效降解菌TB1相比,菌株CTN-11的降解效率明显高于TB1。菌株TB1需在其他碳源存在的情况下,于120h内将30mg·L-1的百菌清完全降解。对菌株CTN-11来说,添加碳源可增强降解,但并不是降解所必需的。研究表明,菌株CTN-11可通过水解脱氯将CTN降解为对鱼类和无脊椎动物微毒的羟基百菌清(CTN-OH),但CTN-OH却不能被进一步降解。为了进一步研究CTN水解脱氯的代谢过程,Wang等分离到了另1个CTN降解菌Pseudomonassp.CTN-3,该菌株具有水解脱氯酶活性。从CTN-3中克隆到1个编码CTN水解脱氯酶的基因chd,与目前报道的唯一一个水解脱氯酶(4-氯-辅酶A脱卤酶)代谢途径显著不同。在厌氧和有氧条件下,该酶均可进行水解脱氯反应,并且不需要辅因子如辅酶A和ATP的存在。该研究为卤化芳香族化合物水解脱卤机制的研究提供了一个更好的脱氯酶。2.6拟除虫菊酯农药拟除虫菊酯是一类重要的杀虫剂,这一家族的农药结构复杂,其微生物降解受到关注。Wang等分离到1株Sphingobiumsp.JZ-1菌株,JZ-1可以通过水解作用降解多种拟除虫菊酯农药。从JZ-1中克隆到1个羧酸酯酶基因pytH,该基因编码1个相对分子质量31×103的菊酯水解羧酸酯酶(PytH),与已发现的菊酯水解酶没有任何同源性,与α/β折叠水解酶家族的同源性为20%左右,显示PytH是一个新的农药水解酶。3污染物降解中中间代谢产物的检测微生物通过一系列的生理生化过程来分解农药等污染物,通过中间代谢产物的分析可以重构微生物的降解代谢途径。现代仪器分析手段的引入,如GC-MS、LC-MS以及核磁共振等技术,可以有效地检测污染物降解过程中的中间代谢产物。目前,很多降解微生物的代谢途径已被发现,微生物降解转化数据库(biocatalyst/biotransformationdatabase,UM-BBD)收录了超过200种污染物的降解代谢途径。我们在已知降解微生物代谢途径的基础上分别对氯乙酰胺类除草剂、菊酯杀虫剂、百菌清杀菌剂的降解代谢途径做了一系列深入的研究,使人们更加详细地了解微生物对农药的降解并为农药的环境修复提供了基础。3.1氯乙酰胺类从碳源生长规律分析氯乙酰胺类除草剂是酰胺类除草剂的重要成员,Zhang等从水稻土中分离到1株氯乙酰胺类除草剂高效降解菌Paracoccussp.FLY-8。菌株FLY-8可降解并利用6种氯乙酰胺类除草剂作为碳源进行生长,降解率从大到小依次为甲草胺、乙草胺、异丙草胺、丁草胺、丙草胺、异丙甲草胺。分析了氯乙酰胺类除草剂的分子结构对降解率的影响,发现侧链烷基越长,降解效率越低。在FLY-8降解过程中检测到了甲草胺、2-氯-N-(2,6-二乙基苯基)乙酰胺及2,6-二乙基苯胺等中间代谢产物。由于FLY-8能够利用苯胺进行生长,推测丁草胺是通过图4中的降解代谢途径实现完全矿化。该研究为菌株FLY-8在氯乙酰胺类除草剂及含有该类除草剂环境的原位生物修复的使用提供了重要的潜在可能性。3.2-苯氧基苯甲醛和3-四甲基环丙酸酯Guo等从拟除虫菊酯生产废水的活性污泥中分离到1株广谱的菊酯降解菌SphingobiumfaniaeJZ-2,可降解甲氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和联苯菊酯。菌株JZ-2具有菊酯水解酶活性,通过酯键断裂降解甲氰菊酯,生成3-苯氧基苯甲醛和2,2,3,3-四甲基环丙酸(图5)。3-苯氧基苯甲醛、3-苯氧基苯甲酸、原儿茶酸钠和邻苯二酚是甲氰菊酯降解的中间产物。3-苯氧基苯甲酸和邻苯二酚通过邻位裂解途径被进一步氧化。3.3-pnpa和4-苯三酚的分离和代谢硝基酚类化合物是重要的环境污染物,其中的4-硝基苯酚(PNP)被列为优先控制污染物。根据PseudomonasputidaDLL-E4对硝基苯酚降解过程中关键酶的功能及代谢中间产物分析,我们建立了P.putida中硝基酚类化合物的代谢途径。假单胞菌DLL-E4通过PNP-4-单加氧酶PnpA将PNP转化为对苯二酚(HQ),在HQ双加氧酶的作用下进行开环,并在一系列酶的作用下转化成β-酮己二酸,进入到三羧酸循环(TCA)。DLL-E4可以PNP为唯一碳源进行生长,但不能降解其类似物4-硝基邻苯二酚(4-NC)。当同时存在对硝基苯酚和4-硝基儿茶酚时,则二者均可以被利用。功能分析表明PnpA可以作用于PNP和4-NC,但4-NC单独不能诱导PnpA的表达,因此菌不能利用4-NC为唯一碳源进行生长。4-NC转化生成的1,2,4-苯三酚(BT)可以被PnpC开环,进入到HQ的代谢途径中。通过对pnp基因簇功能验证结合质谱分析,我们认为该基因簇编码了2个硝基苯酚类化合物代谢途径:PNP降解的对苯二酚途径和4-NC降解的偏三苯酚途径(图6),不同于现在已报道的来源于其他微生物的PNP代谢途径。4微生物残留降解研究表明,农药喷施到田间后,其残留会造成严重的农田环境面源污染,造成农产品品质下降,进而影响人类的身体健康。生物修复是一种低成本的环境友好型面源污染修复技术。大量的研究结果显示农药降解菌在实验室纯培养条件下可以高效地降解化学农药。因此,研究降解菌在田间条件下对农药残留的降解,可以为其在生物修复中的应用提供理论依据和实际指导。张瑞福等和蒋建东等以韭菜中的农药为对象,研究了微生物降解技术在农药残留降解方面的重要作用。研究发现,施用高效农药残留降解菌剂能显著降低韭菜中农药残留的含量;在一定范围内,降解率随着菌剂用量的增加而升高,同时控制降解菌使用时间不会对虫害的防治产生不利的影响。Huang等将Pseudomonassp.IM-4接种至咪草烟处理过的灭菌土壤,与未接菌相比,咪草烟的降解率提高5倍;将IM-4接种至咪草烟处理过未灭菌土壤,与对照相比,咪草烟降解率提高3倍,并发现菌株IM-4可减缓咪草烟对玉米的毒害作用。这些研究为无公害农产品的生产提供了新的思路。施用到土壤中的降解性微生物与土著微生