大鼠下丘脑室旁核精氨酸血管加压素mrna的表达与免疫应答反应的关系

大鼠下丘脑室旁核精氨酸血管加压素mrna的表达与免疫应答反应的关系

据报道，大脑室侧核（pvn）引起的精氨酸血管压素（avp）可通过神经内涵或下降射点来调节身体的免疫功能。当身体受到刺激和免疫抑制时，不仅vn大细胞内侧的avp蛋白和avpmrna含量增加，而且可以在小细胞内检测到明显的avp蛋白和avpmrna。为在分子水平揭示PVN内AVP神经元与免疫应答反应间的内在联系,我们研究了免疫应答不同时期大鼠PVN内AVPmRNA含量的动态变化规律。1材料和方法1.1材料表面1.1.1各组的饲养情况成年雄性SD大鼠(本校实验动物中心提供)100只,体质量210～280g,随机分为免疫增强组(E组)及其对照组(EC组)和免疫抑制组(I组)及其对照组(IC组),各组再分为5组,每组5只,分别记为E1～E5组、EC1～EC5组、I1～I5组和IC1～IC5组,分笼喂养,自然摄食和光照。1.1.2para-pcr扩增、去离子甲酰胺,pasaa,parasna,parasna,parta,paras-brl,na,paras,pa-b,pa-b.pla-brl-pa-ha的合成地高辛寡核苷酸末端加尾标记试剂盒(Roche公司),地高辛检测试剂盒(Roche公司),聚庶糖(Ficoll400,Pharmacia),硫酸葡聚糖(Sigma公司),聚乙烯吡咯烷酮(PVP,Sigma公司),蛋白酶K(GIBCO-BRL公司),鲑鱼精DNA(ssDNA,GIBCO-BRL),去离子甲酰胺(GIBCO-BRL公司),RNA酶A(RNaseA,GIBCO-BRL公司),tRNA(GIBCO-BRL公司),rRNA(GIBCO-BRL公司)等。1.2方法1.2.1间脑冰激凌试验见文献。分别取E1组、E2组、I1组、I3组及其对照组大鼠的间脑冰冻连续切片(30μm),间隔取片并裱于硅化的载片上,40g/L多聚甲醛固定后,乙醇逐级脱水,室温干燥,-20℃冻存。1.2.2互补寡核苷酸链5-ga仍合成法以编码SD大鼠AVP前体糖蛋白前16个氨基酸的mRNA核苷酸序列5′-CUU-AGGCUGGUACAGCUGGCUGGGACACAAGA-GUCCGUGGAUUCUGCU-3′为模板,用DNA自动合成仪(美国生命科学技术公司)合成一段互补寡核苷酸链5′-GAATCCGACCATGTCGACCGA-CCCTGTGTTDNACTCAGGCACCTAAGACGG-3′为探针,经地高辛标记、检测合格后-20℃冻存待用。1.2.3多聚甲醛和三乙醇胺作用时间切片经0.2mol/LHCl室温作用20min,1mol/LTris-HClEDTA缓冲液洗5min后依次经0.03mg/ml蛋白酶K消化20min(37℃),2g/L甘氨酸PBS作用10min,40g/L多聚甲醛作用20min,2.5ml/L乙酸酐和0.1mol/L三乙醇胺作用10min,上述各步骤间分别用1×PBS洗5min×3次。梯度酒精脱水,室温干燥后,滴加杂交液(20μl/片,探针浓度2.5ng/ml)50℃杂交16～18h;500ml/L甲酰胺振摇洗涤、1×NET浸泡(37℃),RNaseA(20μg/ml)37℃消化30min后,依次经2×SSC、0.2×SSC液洗涤1h,1×马来酸缓冲液室温洗涤10min,滴加Anti-Dig-AP抗体(1∶1000)20μl/片,37℃孵育30min,滴加NBT/BCIP(1∶50),避光显色2h(37℃),自来水洗,空气干燥,二甲苯透明封片,镜检并拍照。1.2.4比较实验设立RNase预消化、阴性对照及竞争性吸收等对照实验。1.2.5pvn内阳性杂交信号的平均粒度和平均粒度用Mias图像分析系统(Mias2000-B型,四川大学计算机图像图形研究所)对每张切片上PVN内AVPmRNA阳性杂交信号的平均灰度(256级)及其总面积测定(自动灰度门限分割),同时对细胞轮廓清楚、细胞核明显的每个细胞内的AVPmRNA阳性杂交信号的平均面积和平均灰度进行测定。1.2.6统计方法图像分析结果作单因素方差分析和组间两样本均数比较的t检验。2结果2.1细胞内avpmna表达变化AVPmRNA杂交阳性细胞在各组大鼠PVN内均呈双侧对称性分布,以尾段的外侧小细胞区和中尾段的后大细胞区内数量最多,前小细胞区及内侧小细胞区次之,前大细胞区和内侧大细胞区内最少。AVPmRNA阳性杂交信号呈粗细不等的紫蓝色颗粒,不均匀地分布于核周体及一些细胞突起的起始段内,胞核内几乎没有AVPmRNA阳性信号(图1);颗粒的染色在免疫反应高峰期最深,免疫抑制极低时最浅。AVPmRNA阳性杂交信号在PVN内的分布范围以免疫反应抑制极低时最小,免疫反应高峰期时最大(图1～3)。2.2pvn单次给药后avpmna阳性杂交信号的平均灰分率i1见附表。两抑制组大鼠PVN单个细胞内AVPmRNA阳性杂交信号的平均面积显著低于其对照组和增强组(P<0.05)。AVPmRNA阳性杂交信号在PVN头、中、尾段所占的总面积在免疫反应高峰期组(E2组)显著大于免疫反应开始增强组(E1组),且两免疫增强组均明显大于其相应的对照组(EC1、EC2,P<0.05),见图1、2、3。但两对照组之间比较差异无显著性(P>0.05);免疫抑制极低组(I3组)显著低于免疫反应开始受抑制组(I1组)(P<0.05),结果显示AVPmRNA阳性杂交信号在PVN内的总面积随免疫反应的减弱而逐渐减小。PVN单个细胞内AVPmRNA阳性杂交信号的平均灰度在免疫反应高峰期组(E2组)明显低于免疫反应开始增强组(E1组),且均低于其相应的对照组(P<0.05),见图1、2、3,免疫抑制极低组(I3组)明显高于免疫反应开始受抑制组(I1组),该两组均明显高于其相应的对照组(IC1组,IC3组,P<0.05),结果显示单个细胞内AVPmRNA阳性杂交信号的平均灰度在免疫反应高峰期时最低,而免疫抑制极低时最高。整个PVN内AVPmRNA阳性杂交信号的平均灰度在免疫反应高峰期组(E2组)显著低于免疫反应开始增强组(E1组),且两增强组均显著低于其相应的对照组(P<0.05),见图1、2、3;相反,免疫抑制到最低组(I3组)却显著高于免疫功能开始受抑制组(I1组,P<0.05),且两抑制组的平均灰度均显著高于其相应的对照组(P<0.05)。结果显示PVN内AVPmRNA阳性杂交信号的平均灰度值随免疫反应的减弱而逐渐增强。3pvn内的免疫调节作用本研究在正常对照组和实验组大鼠PVN的大、小细胞区内均观察到AVPmRNA阳性杂交物,且其在PVN内所占的总面积与免疫应答反应的强度成正比。我们的实验结果与文献报道基本一致,但与Guitteny等在正常大鼠PVN小细胞神经元内未观察到AVPmRNA的表达的报道存在差异,此差异的出现可能与采用的实验材料和方法不同有关。本实验及前人的研究结果均提示AVP的免疫调节作用与PVN内AVP基因的转录密切相关。本研究结果显示,AVPmRNA阳性杂交信号在PVN内所占的面积与免疫反应的强度成正比关系,而杂交阳性信号在PVN内的平均灰度值则与免疫应答反应的强度呈反比。由于平均灰度值的大小与阳性杂交物的相对含量呈负相关,而总面积的大小则与AVPmRNA阳性杂交物的含量呈正相关。故本研究从总面积和平均灰度值两个方面揭示了PVN内AVPmRNA的含量随着免疫反应的增强而增多,随免疫反应的减弱而减少的动态变化规律,提示AVP的免疫调节作用与AVP基因的及时转录密切相关。研究显示免疫细胞产生的IL-1可激活PVN内的核因子NF-κB,继而通过IL-1-CRF—ACTH网络参与免疫调节活动。另有研究证实免疫刺激或切除肾上腺均可增加大鼠PVN内CRF神经元的AVP-肽和AVPmRNA含量,正中隆起内AVP肽的浓度随之增加,血中ACTH水平上升,毁损PVN则可降低或阻断ACTH的分泌。上述研究提示PVN产生的AVP可协同CRF促进ACTH的分泌,进而促进糖皮质激素(glucocorticoid,GC)的产生而抑制免疫反应。研究还证实GC可反馈抑制PVN内小细胞神经元AVP基因的转录,以保持PVN内AVP含量的动态平衡。结合本研究结果与前人的报道,我们推测,机体受免疫刺激后PVN内AVPmRNA含量的增加,可能是免疫活性物质通过受体的作用激活了PVN内的NF-κB,进而启动了AVP基因转录的结果。增加的AVP通过下丘脑—垂体—肾上腺轴的途径反馈抑制免疫反应,以维持机体的免疫平