色甘酸钠穴区注射后大鼠穴区肥大细胞及痛阈值变化

色甘酸钠穴区注射后大鼠穴区肥大细胞及痛阈值变化

彩微酸钠（scg）是一种由肥大细胞（mc）产生的膜试剂，具有稳定mc和抑制脱颗粒的作用。临床上,色甘酸钠制剂通过抑制MC活性,对变态反应性疾病的治疗效果显著。研究表明,MC与经络穴位密切相关,穴区组织内MC功能活性变化对穴位功能、针刺信息的传递及针刺效应产生直接影响。电针刺激可以激活穴区MC活性,促进MC聚集和脱颗粒,产生针刺效应。本实验采用SCG进行穴位封闭,观察SCG是否对电针激活MC以及所产生的针刺效应存在影响并报道如下。1材料和方法1.1g,scxk-军清洁级Wistar雄性3月龄大鼠40只,体重120g～150g,由中国军事医学科学院动物中心提供(SCXK-(军)2007-004)。实验过程中对动物的处置遵照科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。1.2mama公司色甘酸钠(SodiumCromoglicate)、硫化乙酰胆碱碘盐,美国Sigma公司;甲苯胺蓝(ToluidineBlueO),美国Amresco公司;恒冷箱切片机,英国ThermoFisherScientific公司;韩氏电针仪LH202H型,北京华卫产业公司;YLS-12A鼠尾光照测痛仪,淮北正华生物仪器有限公司。1.3scg+电针大鼠穴位注射前基础痛阈值检测将40只大鼠随机分为正常组、电针组、SCG组、SCG+电针组,每组各10只。正常组:不给予任何刺激的健康大鼠。电针组:按实验针灸学描述选取大鼠左侧足三里穴,即膝关节后外侧腓骨小头下约5mm处,用0.5寸针灸针直刺入7mm;将针连接电针仪,电针参数为强度:0.1mA,频率:2/15Hz,时间:25min。电针结束后大鼠饲养过夜。SCG组:将2%SCG注射液由深至浅分别注入左足三里穴各50μl,大鼠饲养过夜。SCG+电针组:将2%SCG注射液由深至浅分别注入左足三里穴各50μl。注射20min后,各穴给予电针刺激,针刺方法、参数与电针组相同。电针结束后大鼠饲养过夜。正常组大鼠固定于测痛仪上,待其稳定后检测记录痛阈值,作为基础痛阈值;25min后再进行痛阈值检测,作为实验后痛阈值。电针组大鼠检测电针刺激前的基础痛阈值,电针结束待其稳定后再进行痛阈值检测,作为实验后痛阈值。SCG钠组大鼠检测穴位注射前的基础痛阈值,注射25min后待其稳定再进行痛阈值检测,作为实验后痛阈值。SCG+电针组大鼠检测注射前基础痛阈值,电针结束后再进行痛阈值检测,作为实验后痛阈值。每只大鼠每次痛阈值检测均进行2次,每次间隔2min,取平均值。1.4肌肉组织染色各实验组电针结束后处死动物,取左足三里穴区组织块(包括皮肤、皮下组织和少量肌肉组织,约1cm×1cm×0.4cm)编号,速冻于恒冷箱切片机内,切片厚20μm,进行乙酰胆碱酯酶组化染色加甲苯胺兰复染,酒精逐级脱水,二甲苯透明,中性快干胶封片。1.5实验数据和痛阈差值在光学显微镜下,每只大鼠观察“足三里”穴区的32张切片,每张切片以小血管标记(直径100～200μm),每张切片3个视野,分别记录下MC数及脱颗粒数。脱颗粒率计算公式:脱颗粒率=脱颗粒细胞数/MC数,取平均值作为该穴区组织的脱颗粒率,进行MC数及脱颗粒率的组间比较;求出每只大鼠的痛阈差值:痛阈差值=实验后痛阈值-基础痛阈值,并进行组间比较。所有数据用均数±标准差表示。应用SPSS13.0统计软件进行处理,各组间差异采用单因素方差分析,2组间差异采用LSD检验进行分析,P<0.01为具有统计学意义。2结果2.1两组穴区mcs分布情况在光学显微镜下观察到,各实验组“足三里”穴区真皮、皮下组织和肌肉组织各层中分布着大小、数量不等的MC,多聚集在小血管和神经周围,皮下组织层MC分布最丰富。电针组穴区MCs分布比正常组增多,SCG组和SCG+电针组穴区MC均明显减少(见图1A、1B、1C、1D)。表1显示,各组穴区MC数依次为电针组>正常组>SCG+电针组>SCG组,其中SCG组MC数与其余各组比较,SCG+电针组MC数与其余各组比较,均具有统计学意义(P<0.01)。2.2scg和电针对mrs-mc细胞脱颗粒的影响正常组大鼠穴区MC形状规则,多呈圆形或椭圆形,胞质内颗粒密集,着色深,少量细胞发生脱颗粒(见图1A)。电针组MC胞质内颗粒间距增大,着色浅,多数细胞胞膜破裂,释放大量颗粒,散布在细胞分泌面周围,或在胞膜附近聚集成团、带状(见图1B)。SCG组多数MC轮廓呈现不规则的四边形几何形状,胞质内颗粒密集,部分细胞有脱颗粒趋势,但颗粒尚未或较少脱出(见图1C)。SCG+电针组MC形态与SCG组相似,偶而有MC胞膜周围存在少量脱出的颗粒物(见图1D)。表1显示,各组穴区MC脱颗粒率分析比较为电针组>正常组>SCG+电针组>SCG组;其中,SCG组MC脱颗粒率与电针组、正常组比较,SCG+电针组MC脱颗粒率与电针组比较,电针组MC脱颗粒率与正常组比较,均具有统计学意义(P<0.01)。2.3痛阈值测定表1显示,正常组大鼠25min前后痛阈值呈现轻微波动;电针组电针25min后,大鼠痛阈值升高;SCG组和SCG+电针组大鼠实验处理后痛阈值均出现下降,各组大鼠痛阈差值比较为电针组>正常组>SCG+电针组>SCG组,SCG+电针组大鼠痛阈差值与电针组、正常组比较,SCG组痛阈差值与电针组、正常组比较均具有统计学意义(P<0.01)。3scg穴区注射抑制mc聚集和脱颗粒的作用机理SCG是一种抗变态反应药物,药理机制研究发现,它对细胞活化的氯离子通道具有调节功能,可使细胞处于正常休息的生理状态。SCG的主要作用是稳定MC膜,通过减少钙离子内流,抑制细胞胞吐过程中参与信号传导的关键介导物细胞磷脂酶D(PLD),从而抑制MC活化和脱颗粒,减少组胺、TNF2α、慢反应物质的释放。研究表明,在过敏性鼻炎和哮喘、特异性湿疹、肥大细胞增生病等变态反应疾病治疗中,色甘酸钠制剂可以有效抑制机体组织中MC的活性,显著改善和治疗病证。MC是生物体内一种十分重要的细胞,在维持机体生理功能、参与病理反应方面均发挥作用,有“万能细胞”之称。MC胞质颗粒内含有多种生物活性物质,如组织胺、蛋白多糖、中性蛋白酶及多种白细胞介素(IL)等。当机体组织感受刺激时,组织局部大量MC聚集,释放颗粒内的物质(常称为脱颗粒);参与、介导细胞因子网络中多种反应,MC脱颗粒是其实现生物学作用的关键步骤。研究表明,电针刺激可以促进大量MC向穴位局部迁移、募集,引起穴区MCs大量脱颗粒,参与针刺效应传递。电针镇痛效应的产生就与电针促进MC脱颗粒、参与神经调节相关。本实验为观察SCG对电针刺激后MC功能的影响,采用新的组织染色方法,清晰显示电针和SCG穴位注射后组织中MC的形态结构。实验观察到,SCG注射后,无论电针或不电针刺激,穴区皮下组织层中MC形态均发生改变,MC数和脱颗粒率下降;而单纯电针刺激的穴区MC数和脱颗粒率均高于正常状态。这一结果表明,SCG不仅可以抑制正常穴区MC聚集和脱颗粒,对电针促进穴区MC聚集、迁移和脱颗粒的效应同样具有抑制作用。同时,对实验前后各组大鼠痛阈值比较发现,电针组大鼠痛阈值升高,SCG注射组和SCG+电针组大鼠痛阈值均下降;穴位注射SCG可以使电针后大鼠痛阈降低。研究表明,电针刺激可以促进穴区MC聚集和脱颗粒,这与电针镇痛效应产生的关系密切。因此,在实验研究中,痛阈值变化常常作为反映电针调节MC功能的一个指标。根据实验结果我们初步分析认为,SCG可以抑制MC膜的活性,穴区SCG注射后穴位局部组织MC的活性被封闭,细胞数量减少,