视网膜道的免疫组织化学研究

视网膜道的免疫组织化学研究

视觉损伤可导致严重的视觉损伤和昏迷。视力损伤的病理基础突出于视网膜图像的损伤。以往的研究主要集中在延长节细胞的死亡，防止轴突变形，改善节细胞的生存，促进视觉再生。断端移植自体坐骨神经后可观察到视网膜节细胞(retinalganglioncell,RGC)轴突与上丘重新建立有效的突触联系并恢复瞳孔对光反射,但精细视觉恢复不理想。这提示视觉功能恢复除注意节细胞与其下一级神经元之间的突触联系外,视网膜内部各神经元之间的突触联系的完整性也可能有着重要作用。因此,本实验拟观察视神经切断后视网膜内部的突触是否出现变化,选取视网膜双极细胞作为研究对象,以Alpha蛋白激酶(PKC-α)和recoverin标记不同类型双极细胞,通过观察双极细胞及其轴突终末在视神经损伤后的形态变化来探讨视神经损伤后在双极细胞与RGC之间是否存在突触可塑性变化。材料和方法1.动物嘴唇要求健康成年SD大鼠41只,雌雄不限,由中南大学实验动物学部提供。要求动物双眼等大,角膜透明,瞳孔规则。随机分为正常组(5只)、假手术组(6只)及实验组(30只)。实验组行右侧眶内视神经切断术,术后分别存活3、5、7、14、21、28d,共6组,每组5只。2.视网膜电泳图大鼠用10%水合氯醛腹腔注射(0.5ml/100g)麻醉。将其头部固定于脑立体定位仪上,用0.25%氯霉素眼药水滴眼,显微镜下暴露视神经,划开视神经鞘,于球后2mm处切断视神经,切断前预置一丝线于视神经下方,切断后将丝线从两断端间拉出以确证其已完全切断,此时可见动物瞳孔极度扩大,注意避免损伤视网膜中央动脉,术后用0.25%氯霉素眼药水滴眼,动物分别存活3、5、7、14、21、28d。假手术组除不切断右眼视神经外,其余步骤与实验组相同,动物存活7d。3.蔗糖与pb液的耦合存活相应时间后,断颈法处死动物,取双侧眼杯立即放入含4%多聚甲醛的PB液中4℃冰箱中固定24h,之后分别浸入含15%、30%蔗糖的0.1mol/L的PB中,pH7.4,ShanDon冰冻切片机切片(片厚15μm)。4.兔抗的合成切片用3%过氧化氢-甲醇室温下孵育10min,0.01mol/LPBS清洗后,5%BSA37℃封闭1h后置于一抗(兔抗PKC-α1∶1000,SantaCruz或兔抗recoverin1∶1000,Chemicon)4℃冰箱中过夜,0.01mol/LPBS清洗后加入生物素化羊抗兔IgG,37℃孵育2h,PBS清洗后入1∶200ABC液,室温下1h,0.05%DAB呈色,PBS终止反应,常规脱水、透明、中性树胶封片。5.视网膜免疫组化每只动物各取3张染色切片,每张切片上在Motic显微镜40倍物镜下以视神经为中心对称取6个部位,用Motic公司imagesadvanced3.2图像采集系统采集视网膜图像,计数内核层(innernuclearlayer,INL)的双极细胞及内网层(innerplexiformlayer,IPL)的免疫阳性位点。各组数据用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,并选择单因素方差分析进行统计分析,以P<0.05视为显著性差异。结果1.pkc-阳性双极细胞数目fig正常视网膜内核层、内网层及节细胞层均呈PKC-α免疫阳性反应。位于内核层外侧的PKC-α阳性细胞胞体呈锥形,排列密集,有分叉状树突伸向外网层,另有一长轴突伸向内网层内带,终末为椭圆形的粗大颗粒状结构,油镜下观察这些颗粒状结构与轴突相连,椭圆形,境界清晰,可判断为轴突终扣(Fig.1)。对内网层的PKC-α阳性产物计数并统计发现视神经切断后5d内网层阳性反应轴突终扣数目开始明显增多,14d时达到峰值,21、28d又逐渐减少。以上时间组PKC-α阳性轴突终扣数与正常组和假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01,表1),而内核层外侧PKC-α阳性双极细胞数目各实验组与正常组间无明显差异。组织切片行苏木素复染后,节细胞计数显示视神经切断后5d节细胞开始减少,这种趋势一直持续到28d(数据未列出)。2.抗炎性轴突终扣正常视网膜外核层、内核层、内网层及节细胞层均有recoverin阳性产物表达,表现为胞浆浓染,胞体境界清楚。内核层阳性细胞胞体呈椭圆型,有树突伸向外网层,另有一长的轴突伸向内网层,末端膨大终止于内网层的内侧,表现为两条平行颗粒状条带。油镜下这些阳性颗粒与轴突末端相连,圆形或椭圆形,边界清晰,可判断为轴突终扣(Fig.2)。对内核层的recoverin阳性细胞计数并进行单因素方差分析显示:recoverin阳性细胞数在视神经损伤后7d时开始减少,以后各时间点逐渐减少,与正常组比较差异均有显著性(P<0.01)。内网层可观察到免疫阳性条带在损伤早期逐渐增厚,21d及28d厚度逐渐变薄,其中的轴突终扣排列出现紊乱,两条阳性条带的界限逐渐模糊,甚至融合(Fig.2)。内网层的recoverin阳性反应轴突终扣在视神经切断后5d内网层a、b亚层的轴突终扣数增多明显,14d达到峰值,21d后开始减少,统计学分析结果显示各实验组阳性轴突终扣数目与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.05,表2)。视网膜节细胞突变PKC-α和recoverin能标记双极细胞中大部分类型,被广泛地用作双极细胞的标记物,它们的表达变化可作为双极细胞数目、功能变化的指标。正常视网膜中PKC-α主要分布在ON-视杆型双极细胞的树突、胞体和与节细胞形成突触的突触前终末上,同时根据ON-双极细胞的胞体位于内核层的外半部分的特征判断,本实验中位于视网膜内核层外侧,排列紧凑,胞体呈锥形的细胞应为ON型视杆型双极细胞。正常视网膜中recoverin及其mRNA主要表达在外核层的视锥视杆细胞、ON型和OFF型视锥型双极细胞及节细胞层中。视锥型双极细胞的轴突终末分别在内网层的a、b亚层与视网膜节细胞形成突触,故在内网层表现为两条平行的颗粒带。Recoverin可标记大部分OFF型双极细胞,这类双极细胞的减少可能与它们和节细胞有直接突触联系相关。许多研究结果和本实验均表明视神经切断后5d节细胞开始大量死亡,7d和14d为两个死亡高峰。而当节细胞因视神经切断损伤大量死亡后,OFF型双极细胞与节细胞的突触联系受到影响进而中断,导致细胞间的信息及神经营养因子的来源受阻,因而recoverin表达下调。本实验中recoverin的表达下降模式进一步说明了其受节细胞影响的可能性。视神经损伤后PKC-α阳性双极细胞数量变化不明显,而recoverin阳性双极细胞数量逐渐减少,这两种对视神经损伤的不同应答提示我们,视神经损伤后,与节细胞形成直接突触联系的OFF型双极细胞可能更容易发生跨神经元的逆行性溃变,这尚需进一步研究加以证实。本课题组的前期研究发现视神经切断早期视网膜内、外网层突触发生标记物synaptophysin的蛋白及mRNA表达增多,细胞色素氧化酶活性增高,但随着动物存活时间的延长,synaptophysin等物质表达减少,细胞色素氧化酶活性下降。在本实验中,我们观察到内网层中PKC-α及recoverin的阳性产物在视神经损伤早期增加,14d达到峰值后表达开始减少。双极细胞在内网层轴突终扣的分布也有改变,尤其以recoverin阳性双极细胞的轴突终扣变化最为明显。视神经损伤后21d,内网层