脐血内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血的有效性及机制研究

脐血内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血的有效性及机制研究

糖尿病周围的血管病变可以导致脚踢或四肢骨折。成人糖尿病患者中40%的足和下肢非创伤性截肢为糖尿病所致。糖尿病合并周围血管病变时侧支血管形成能力严重受损,糖尿病患者内皮功能失调导致外周侧支血管血供不足为其主要原因。多项实验性治疗措施已试用于糖尿病动物以改善组织缺血,如外源性血管内皮生长因子(VEGF)等,但这些可增加血浆VEGF从而加重微血管增殖性病变,同时缺血组织对外源性生长因子反应性降低。内皮祖细胞(EPC)的生物学特性及其促进缺血组织血管新生的作用使其可作为提高糖尿病血管新生能力的方法之一。而骨髓、外周血和脐血中存在能进一步分化为内皮细胞并参与血管新生的EPC。骨髓、脐血、成人外周血中CD34+细胞比为3∶2∶0.2。目前,有外周血EPC治疗肢体缺血,以及骨髓EPC治疗糖尿病周围血管病变有效的报道。本研究用Ⅷ因子免疫组化法观察腓肠肌毛细血管数及VEGF水平,旨在探究脐血EPC治疗糖尿病下肢缺血病变的有效性及机制。材料和方法一、兔抗大鼠因子的活性选取清洁级雄性Wistar大鼠15只,体重200~250g,6~7周龄,购于重庆腾鑫生物技术有限公司。主要试剂有EGM2(美国Lonsa公司),PE-标记的兔抗人CD133(美国Becman-culter公司),PCYS-标记的兔抗人CD34(美国Becman-culter公司),FITC-标记的兔抗人KDR(美国Becman-culter公司),绿色荧光(GFP,美国cyagen公司),链尿佐菌素(STZ,美国Sigma公司),兔抗大鼠Ⅷ因子单克隆抗体(北京中杉公司),辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉公司)。二、实验方法1.监产带者在产科取无乙肝、梅毒等传染病正常足月剖宫产产妇脐血,新生儿娩出后,在距脐轮约10cm处用止血钳夹住脐带的两端,于两钳之间剪断脐带,在产妇侧脐带的一端选择粗大而显露的脐静脉,75%酒精消毒,用50ml空针针头向胎盘方向穿刺,穿刺成功后利用子宫阵发性收缩使脐血顺利进入空针,约50ml血液拔针。淋巴细胞分离液分离,取中间白膜层离心加入EGM2,用纤维连接蛋白包被培养瓶培养,隔日换液1次,共培养7d(图1)。2.色细胞数/细胞总数计算将贴壁细胞用0.2%EDTA消化,计数细胞总数并计数蓝色细胞数(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数=活细胞数比例。活细胞数占98%。流式细胞仪鉴定CD133、CD34、KDR含量。部分培养7d的脐血EPC吸掉原液,加入GFP,48h在荧光显微镜下观察转染情况,转染成功后再将细胞进行消化,移入大鼠(图2)。3.皮肤微核试验将大鼠一次性腹腔注射1%STZ造模,余下大鼠注射柠檬酸缓冲液作为对照。血糖稳定后给予1%戊巴比妥钠麻醉,并用137源1.25GY的γ射线全身照射减轻大鼠排斥反应。射线照射后结扎双后肢股动脉,直至处死大鼠。结扎后7~10d,部分大鼠结扎肢出现皮肤溃疡。在出现溃疡次日,糖尿病大鼠尾静脉注射EPC的为DE组,尾静脉注射缓冲液(PBS)的为DP组,正常大鼠尾静脉注射EPC为NC组。4.荧光显微镜观察将转染了GFP、EPC的大鼠于注射后第7天处死,制作冰冻切片,在荧光显微镜下立即观察表达情况,了解各组荧光表达强度。其余大鼠于第21天处死,将腓肠肌组织作HE染色与Ⅷ因子免疫组化S-P染色,观察毛细血管数且RT-PCR检测VEGFmRNA含量。三、统计方法采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料以表示,组间比较采用单因素方差分析及SNK-q检验。结果一、东盟内皮祖细胞的标志因子流式细胞仪测定显示,所培养细胞含CD34、CD133、KDR3个内皮祖细胞的标志因子。其中CD34含量最多,为50.7%,CD133含量次之,为20.2%,KDR含量最少,为1.29%。(图3)二、de组患者血糖检测糖尿病大鼠在腹腔注射STZ2d后,出现饮水量、尿量明显增加,消瘦、精神倦怠、活动量减少、腹泻等症状,且皮毛无光泽。第3天检测FBG,发现血糖明显增高,DE组缺血肢缺血逐渐改善,溃疡面积逐渐变小,有的痊愈。而DP组缺血肢在换药处理下伤口有所好转,但明显比注射肢慢,溃疡面积变化不大。三、研磨结果表明，荧光显示,DE组腓肠肌均有绿色荧光表达,且明显;DP组腓肠肌无表达。(图4)四、血管内皮毛细管数dp注射EPC的大鼠腓肠肌中毛细血管数明显,DE组每低倍镜下均数为(18.75±4.35),NC组为(21±2.94),DP组毛细血管数表达很少,每低倍镜下均数(4.75±0.96),DE组与DP组毛细血管数差异有统计学意义(P<0.05)。(图5~6)五、组vegfmrna比较将扩增的各组大鼠腓肠肌VEGFmRNA进行检测,DE组和NC组比DP组明显增加,DE组均数为(2.621±0.414),NC组均数(3.121±1.734),DP组均数(1.029±0.293),3组间VEGFmRNA差异有统计学差异(P<0.05)。u3000各指标检测血管内皮功能糖尿病足病(DF)属于下肢慢性缺血性疾病,截肢率高,甚至危及患者生命,传统的药物治疗、血管搭桥及支架置入的远期疗效均不理想且缺乏代偿性侧支的患者,采用任何手段都难使血管再通,足部坏疽时截肢往往是患者和医生的惟一选择,有些患者截肢后仍危及生命。EPC是一种干细胞,具有自我增殖、定向归巢的特性,可定向分化为血管内皮细胞,促进血管新生,修复损伤内膜。成人后骨髓、脐血以及外周血中都可以分离出EPC。脐血中EPC细胞含量丰富,明显超过成人外周血含量,相当于成人骨髓中的含量。Kim等应用脐血EPC移植治疗Buerger病,结果显示,细胞移植后患者静息痛缓解,肢体皮肤溃疡4周愈合,血管阻力降低,血管造影显示肢体远端毛细血管密度增加、直径加大。本研究取足月产妇脐血分离后培养细胞7d,流式细胞仪鉴定CD34最多,CD133次之,KDR最少,与文献报道EPC早期(培养7d)CD34最多(73.5±6.3)%,CD133次之(46.4±9.3)%,KDR最少(33.8±11.7)%一致,到后期(14d)KDR最多(88.9±5.4)%,CD34次之(81.5±7.6)%,CD133最少(3.8±8.7)%,说明所用细胞为EPC。阳性率与文献报道相比稍低,考虑与分离方法、鉴定所用抗体、标记物、文献、灵敏度不一致有关。本研究用结扎大鼠双后肢股动脉制造大鼠下肢缺血模型,与Ebrahimian等给小鼠腹腔内注射STZ来诱导糖尿病的发生,并结扎小鼠右侧股动脉,形成单侧肢体局部缺血的糖尿病动物模型相似。大鼠下肢出现溃疡,免疫组化显示结扎未注射EPC肢毛细血管数明显少,说明缺血模型成立。本研究用Ⅷ因子免疫组化观察毛细血管数,VEGFmRNA观察VEGF量获得内皮细胞量,从而了解微血管形成多少,从基因水平研究脐血EPC治疗糖尿病下肢缺血的疗效。众所周知,CD31、CD34及Ⅷ因子等在大多数内皮细胞上表达并且被命名为泛内皮细胞标记物。Ⅷ因子主要由内皮细胞合成,可作为新生血管的标记,Ⅷ因子相关抗原作为血管内皮细胞的标记物,可观察到新生内皮细胞和微血管密度变化。VEGF是一种特异的作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子。本研究结果表明,DE组毛细血管数比DP组明显增高(P<0.05),VEGF量DE组、NC组比DP组明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05),与于萍等骨髓EPC治疗兔