几种血清学方法检测登革病毒的结果比较

几种血清学方法检测登革病毒的结果比较

病毒登格病毒是一种重要的昆虫传播疾病，主要通过白脸蚊和埃及蚊子感染和传播。它的基因是一个完整的rap，由一个独特的开放读码框架编码三个结构蛋白（c、prm和e）和七个非结构蛋白（ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5）。自然界中存在4种血清型登革病毒,每种血清型感染均可导致登革热、登革出血热以及登革休克综合征,目前广泛流行于全球热带及亚热带地区,对人类健康和公共卫生安全构成了重要威胁。大多数登革热病例的诊断可依据流行病学资料和临床表现,对于非典型或疑似病例,则需要进一步的实验室诊断才可确诊。同时,登革热的临床表现复杂,多数症状非该病特有,与基孔肯亚热等病毒性出血热症状难以区分,必须结合实验室检测结果进行鉴别诊断。此外,登革出血热的发病机制目前尚不清楚,异型登革病毒的二次感染可导致抗体依赖性感染增强(ADE),因此区分初次感染和二次感染具有重要的临床意义。登革热的实验室诊断技术,除经典的病毒分离外,主要针对不同标本中登革病毒特异的抗原、抗体或核酸进行检测,主要包括血清学方法和分子生物学方法。这些诊断方法各具特色,相互补充,临床病例的最终确诊往往需要综合考虑多种方法的检测结果。1血药浓度和感染期ns1抗体的变化登革病毒感染可以分为两个阶段,第一阶段:发热和病毒血症期,血液中可检测到病毒和NS1抗原;第二阶段:发热期过后,体内产生大量的IgG和IgM抗体。患者初次感染登革病毒时,病毒血症一般与发热同步,IgM抗体的出现一般在发病5d后,而IgG抗体一般于发病10~15d后出现,并将长期存在。二次感染时,病毒血症期可持续2~3d,血液中NS1抗原存在的时间可以更长,IgM抗体迅速出现,但滴度远低于初次感染,而IgG抗体滴度将迅速升高。通常,病毒血症结束前或退热前无法检测到IgM抗体的产生。对登革热患者而言,由于突然发热和身体不适,患者一般在发热头2d就去医院就诊。在本阶段,诊断方法只能够检测病毒、RNA或血液中的NS1抗原。血清学诊断方法只有在退热期才会出现阳性,因此急性期和恢复期的双份血清的诊断结果具有重要的临床意义。2在一般意义上的应用病毒分离培养是检测登革病毒感染的金标准,能够对急性期样本进行确认,并能够区分血清型。但是该方法耗时长,一般需要5~10d,需要专业人员和设备,对样本储存和运输要求条件高,因此,在普通实验室很难被推广和应用。登革病毒的分离培养可通过活蚊、细胞或动物进行。活蚊(巨蚊和伊蚊)分离是目前最敏感的登革病毒分离方法,但对接种技术要求高。蚊虫细胞(C6/36、AP-61或TRA-284)分离具有较高的敏感性。此外,也可利用哺乳动物细胞(BHK21、LLC-MK2)或乳鼠颅内接种作为登革病毒的分离培养方法。分离培养物可进一步利用间接免疫荧光法、RT-PCR或流式细胞术来检测登革病毒的存在。3实时实时rt-pcr检测与传统的病毒分离培养方法相比,核酸检测技术更为快速和敏感。登革病毒的核酸检测主要通过RT-PCR及其衍生的相关技术实现。核酸检测技术能够特异扩增病毒基因组RNA,并能够区分血清型,反应时间短,适合急性期标本的检测,具有确诊意义。目前,RT-PCR相关技术种类繁多,各具优势,而且其发展已逐步趋向简化操作,包括从多对引物到一对通用引物、两步法到一步法、多管反应到单管反应等。目前,一般采用登革病毒的通用引物,同时检测4个血清型的登革病毒,然后再进一步鉴定不同的血清型。通用引物分别位于登革病毒的E、NS1、NS3基因或3′-UTR上。Harris等建立了单管多重RT-PCR法,能够在同一反应管中对4个血清型登革病毒RNA分别扩增获得不同长度的片段,进一步简化了操作程序,并提高了检测的敏感性和特异性。实时定量RT-PCR具有反应时间短、污染率低、敏感性及特异性强、自动化程度高、易于标准化等优点,已逐步取代常规RT-PCR用于患者急性期诊断。很多实验室已针对登革病毒基因组的不同区域,建立了型特异的实时RT-PCR检测方法。单管中进行多达4种荧光基团标记的多重实时PCR法也有报道。此外,一些新型病毒核酸检测技术也被用于登革病毒核酸的检测。2001年,Wu等建立了可用于从临床标本中检测登革病毒RNA的核酸序列等温扩增法(NASBA),发现此方法的敏感性与C6/36细胞分离病毒方法相当,检出率达98.5%,相对特异性达到了100%,较ELISA方法更敏感和特异。2005年,Parida等将环介导的恒温扩增方法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)应用于登革病毒的临床标本检测中,可在30min内对登革病毒血清型做出鉴定,其敏感性高于病毒分离培养法和常规的RT-PCR方法。LAMP技术的优势在于特异性强,反应时间短,敏感性高,设备简单,成本低廉,结果易判断,非常适合在发展中国家推广使用。此外,Baeumner等将PCR技术与核酸杂交技术相结合,建立了用于登革病毒检测的生物传感器方法,能够在15min内获得检测结果。在此基础上,又发展出多分析物单膜生物传感器和微液流荧光检测生物传感器,可对登革血清型进行鉴定。尽管基于核酸的检测技术得到了广泛应用,但是尚缺乏统一的标准和试剂,考虑到核酸扩增反应的特殊性,必须制定严格的质控标准和分区操作指南,避免实验室污染和假阳性的出现。4急性期定位检测NS1蛋白是登革病毒感染的主要标志性抗原,NS1蛋白出现时间早于IgM抗体,甚至在检测不到登革病毒RNA的情况下,也可检测到NS1蛋白。但在二次感染患者体内存在抗原抗体复合物,降低了抗原检测方法的敏感性。最近Shu等报道,运用ELISA和斑点印迹法,在初次和二次感染的患者急性期血清中可检测到高浓度的以免疫复合物形式存在的NS1抗原。目前,已有多个商品化试剂盒用于检测登革病毒的NS1抗原。Kumarasamy等对Bio-Rad公司的ELISA试剂盒与病毒分离和RT-PCR方法进行了比较,敏感性高达93.4%,特异性为100%。PanBio研发的NS1特异抗体捕获ELISA试剂盒可识别登革1~4型病毒NS1的交叉抗原结合位点,该方法虽然可检测不同血清型的登革病毒,但研究发现,该试剂盒对登革1型病毒感染的阳性血清检出率较高,而对登革4型的检出率较低。我国Ding等建立的基于型特异性单抗的NS1抗原捕获ELISA,与PanBio试剂相比,其敏感性更高。5关于igg抗体在无法采用病毒分离及抗原检测等直接诊断方法时,用血清学方法检测登革病毒感染是一个很好的选择。由于登革感染患者的体液免疫反应在发病后至少可持续数周,因此标本的采集时间比较灵活。而且免疫球蛋白较稳定,不易被灭活,因此,对于长期暴露在较高温度下的标本,更适用于血清学检测。下面着重阐述IgM/IgG抗体检测方法。大多数登革患者发病3~5d后即可检测到特异IgM抗体的产生。一项调查发现,93%的患者可在发病6~10d内检测到IgM抗体,99%的患者可在发病后10~20d内检测到IgM抗体。同时,IgM抗体可能存在3个月甚至更长时间,单纯IgM抗体阳性有时无法判断近期感染,一般需要双份血清进行确诊。目前已有检测IgM抗体的商业化ELISA试剂盒和免疫层析(胶体金)试纸条,但其敏感性与特异性差异受抗原影响较大。研究人员对4种IgMELISA试剂盒进行比较发现,其敏感性在21%~99%之间,特异性在77%~98%之间。部分疟疾患者和早期登革热感染者会出现假阳性结果。ELISA试剂盒敏感性相对较高,一般需要60~90min获得结果;而胶体金试纸条反应时间短(15~30min),更适用于现场调查。此外,间接免疫荧光法检测IgM抗体在实验室广泛应用,但需要专业人员操作和判断,尚无商品化试剂盒问世。初次感染IgG抗体产生一般较IgM抗体晚,并能够终生存在。急性期和恢复期双份血清IgG抗体4倍升高具有确诊意义。基于IgG抗体的ELISA试剂盒已有较多,尽管其敏感性高于血凝抑制试验,但其特异性同样存在较大变异。此外,IgG/IgM抗体比率常用于区分初次和二次感染。Innis等使用IgM和IgG捕获ELISA法检测登革IgM和IgG抗体,当IgM/IgG比值>1.8时,为初次感染;当IgM/IgG比值<1.8时,为二次感染。当无IgM时,IgG4倍升高为二次感染。Kuno等采用IgM捕获法和间接ELISA法测定登革IgM和IgG抗体,结果发现:当IgM/IgG比值>1.4时,为初次感染;当IgM/IgG比值<1.4时,为二次感染。PanBio公司开发的IgM&IgG联检ELISA试剂盒亦可区分初次感染和二次感染。但是,目前采用捕获IgM/IgG比值法鉴别初次和二次感染尚无一致的标准,