赫坎按蚊种团内重复dna限制酶切长度差异研究

赫坎按蚊种团内重复dna限制酶切长度差异研究

已经证明，大多数真核细胞组的重复dna成分是不稳定的。尽管目前人们对重复DNA序列的功能了解不多,但已有研究报道,重复DNA序列在种群进化中起重要作用。在形态极其相似的耐格里属阿米巴、锥虫、血吸虫等寄生虫的亲缘种间,地理株间,均已发现其重复DNA序列存在差异。赫坎按蚊种团在我国分布广,种团成员多,是我国按蚊属的一个主要类群,其中某些种是我国疟疾和丝虫病的重要媒介。既往所采用的主要以形态学特征为依据的经典分类学方法未能澄清赫坎按蚊种团内种株水平上的分类问题,为此我们采用分子生物学技术,直接比较其基因组中重复DNA序列的限制酶切片段长度差异,以鉴别其亲缘种株。蚊anophele所用的各蚊种均系实验室驯化的品系。除中华按蚊上海品系(Anophelessinensis,Shanghai简称ASS)的来源为江苏省寄生虫病研究所养蚊室外,嗜人按蚊江苏品系(Anophelesanthropophagus,简称ALA)、凉山按蚊四川品系(Anophelesliangshanensis,简称ALS)、小宽按蚊北京品系(Anophelesxiaokuanus,简称AXK)及克劳按蚊(Anophelescrawfordi,简称ACW)的来源均为中国科学院上海昆虫研究所的养蚊室。方法蚊虫DNA的提取及制备、应用限制性内切酶消化各蚊种基因组DNA及琼脂电泳等实验方法均按文献。蚊种基因组dna的消化产物的分子特征1各亲缘种基因组DNABg1Ⅱ酶切长度差异比较中华按蚊上海株,嗜人按蚊江苏株,凉山按蚊,小宽按蚊和克劳按蚊等5个亲缘种的基因组DNA分别经Bg1Ⅱ消化,0.8%琼脂糖(0.5μg/ml溴化乙锭)电泳后,在紫外线透射光检测仪下,各亲缘种的消化产物中都可以见到清楚的重复DNA序列的带(图1)。带型差异表现为各亲缘种重复序列片段的带的数目和分子量不同。中华按蚊上海株基因组DNA的Bg1Ⅱ的消化产物中可见4条代表重复DNA序列的带。其中2条密度较高,分子量分别为3.6和4.7kb。这两条淡带在消化的DNA量<5μg时,仅能在底片上见到。嗜人按蚊江苏株基因组DNA的消化产物中可见4条清楚的带,分子量各为0.64,0.92,2.4和5.4kb,其中尤以0.64kb的带密度最大,而0.92kb的带较淡。凉山按蚊基因组DNA的消化产物中可见1条浓带为0.64kb,2条淡带分子量分别为8.4和9.4kb,在底片上2.4kb处还有1条淡带。小宽按蚊的消化产物中可见1条主带,0.64kb,1条淡带5.6kb。克劳按蚊的消化产物中可见2条重复DNA序列的带,1条深带为0.64kb,1条淡带为0.80kb。除了带型差异外,各蚊种消化产物中大片段的分布有差异。除中华按蚊外,其余4种蚊基因组DNA的消化产物中都显示0.64kb的带,在等量的基因组DNA中,荧光强度基本一致。2各亲缘种基因组HaeⅢ的限制酶切片段长度差异各蚊种基因组DNAHaeⅢ的消化产物的凝胶电泳分析见图2。中华按蚊、嗜人按蚊和小宽按蚊均有两条重复序列DNA的带,分子量各异。凉山按蚊的消化产物中,0.5kb以下可见1条带,克劳按蚊的消化产物在0.6kb处有1条带。这些小片段的带只有用1%的琼脂糖凝胶电泳分离时才能见到。此外,HaeⅢ酶切的特点是消化产物中小片段居多,因此,凝胶下段可见到一些淡带,分子量尚难确定。3各亲缘种基因组DNA的PstⅠ酶切分析各亲缘种基因组DNAPstⅠ的消化产物中都可见到清楚的重复DNA序列的带(图3)。在克劳按蚊、中华按蚊和小宽按蚊中均为2条,但分子量不同,分别为2.2和3.6kb,3.6和0.76kb、1.8和3.6kb;嗜人和凉山按蚊中各见到1条,分子量分别为3.6和0.76kb。除凉山按蚊外,其余4种蚊的PstⅠ的酶切物中,均可见到1条3.6kb的重复DNA的带。PstⅠ的酶切片段的分布虽较均匀,但仍可见到从大片段到小片段递减的趋势。此外,还用大劣按蚊(ADH)和白纹伊蚊(AAB)作了对照观察,这两种蚊的PstI的消化产物中未见到重复DNA的带。5个亲缘种的基因组DNA经3种酶切分析的结果归纳为表2。讨论1重复dna的序列及与其它生物种群的差异真核生物DNA按其拷贝数的频率可以分为单拷贝序列,中等程度及高度重复序列等3类。限制性核酸内切酶是一类识别DNA链内专一性核苷酸顺序,在某一位点上切割DNA两条链的酶,不同的酶有不同的识别位点,如果用这种酶消化基因组DNA,那么将产生一系列大小不同的DNA限制酶切片段。在真核生物的某些重复序列家族中,重复单位的重复频率达上万次。如果重复单位内有某些酶的切点,琼脂糖电泳分析消化产物后,在紫外线检测仪下能显示代表重复DNA序列片段的带。因此,带型的差异,直接反映重复DNA限制酶切长度的差异,表明基因组DNA中重复DNA核苷酸顺序或重复DNA序列数量上的差异。现代分子进化论认为,种群进化的实质是增加种群内重复DNA序列的同源性,同时增加种群间的不连续性。生物种群在进化过程中,某些重复DNA序列既有量的变化,又有核苷酸序列的差异。Mclain(1986)等分析比较了Scutellaris种团的6个亲缘种的蚊基因组中的高度重复DNA的量,结果发现,种间的重复DNA的量变化很大。随体DNA的变化尤为明显,在相近物种的随体序列间虽有着结构相似的重复,然而更令人注目的是无论怎样紧密相近的两个物种间都有明显的差别,这种改变的速率明显地快于物种形成的速率,明显地快于其它物质如同工酶等的变化。因此,比较重复DNA序列的限制酶切长度差异是根据分子结构特点,利用酶切分析技术的原理发展的一种检测DNA结构差异的分子生物学方法。2重复dna的比较在医学昆虫分类中,长期以来,都是以形态作为分类依据,但不能对形态相似的亲缘种进行鉴别。虽然有些学者已经用遗传杂交,同工酶,染色体以及气相层析分析昆虫体表碳水化合物组分等方法对亲缘种进行了分类研究,但仍难以作出可靠鉴定,或难以在流行病学调查中推广应用。我国赫坎按蚊种团成员众多,对种团内某些亲缘种存在的真实性,仅靠形态学,染色体和杂交试验的观察,难以证实。小宽按蚊(北京昌平县)系1981年马素芳基于形态分类提出的一新种。缪建吾等通过杂交试验和后代染色体的观察,提出北京的小宽按蚊与四川的八代按蚊为同种异名。因为两种按蚊人工交配后,其杂交种F1的能育性均正常,杂种的染色体完全联合,性腺和外生殖器发育正常。对中华按蚊和嗜人按蚊的独立存在,也有类似的争议。因为大量成蚊标本观察结果表明,嗜人按蚊的许多特征都不是绝对的。蒋成山等曾比较了中华按蚊和嗜人按蚊的八种同工酶,差异甚微。从表1可以看出,5个亲缘种的基因组DNA,分别往Bg1Ⅱ,HaeⅢ和PstⅠ消化后,显示的重复DNA序列的带型差异完全能够将其区别。结果表明,直接比较基因组DNA中重复DNA序列的限制酶切长度差异,是一