参芎葡萄糖注射液对急性脊髓损伤后运动功能恢复的影响

参芎葡萄糖注射液对急性脊髓损伤后运动功能恢复的影响

脊柱损伤（西医）是临床上常见的疾病，但治疗效果通常不理想。由于分裂成熟的神经分裂生殖能力非常有限，如果骨髓受到治疗，终身残疾率非常高，严重影响了人们的生活质量。因此,如何使用有效的药物保护脊髓损伤后神经元结构的维持,促进脊髓损伤后的功能恢复,是医学工作者一直努力探索的课题。参芎葡萄糖注射液的主要成分为盐酸川芎嗪和丹参素,活血化瘀,通脉养心。有抗血小板聚集,扩张冠状动脉,降低血液黏度,加速红细胞的流速,改善微循环,并具有抗心肌缺血和心肌梗死的功效。常用于缺血性心脑血管疾病,很少报道用于脊髓损伤。生长相关蛋白(GAP-43)是一种与轴突生长密切相关的膜蛋白,参与轴突的生长、突触发育形成和神经再生,在神经元发育和再生过程中高水平表达。神经中丝(NF)是构成神经元胞体和神经轴突细胞骨架的主要成分,在维护神经元的功能和轴浆的转运等一系列与脊髓损伤修复相关的病理生理变化中发挥着重要的作用。本实验通过复制大鼠急性脊髓损伤模型,观察参芎葡萄糖注射液对其运动功能恢复及损伤段脊髓GAP-43和NF200表达的影响,探讨参芎葡萄糖注射液对脊髓损伤功能恢复作用及其机制,为脊髓损伤的临床治疗提供实验依据。1材料和方法1.1试剂和试剂盒参芎葡萄糖注射液(贵州景峰公司);戊巴比妥钠(美国Union公司);多聚甲醛及小鼠抗大鼠GAP-43抗体、小鼠抗大鼠NF200抗体、山羊抗小鼠IgG-HRP、SABC试剂盒、DAB试剂盒(武汉博士德公司);苏木素(北京赛驰公司);鼠抗β-actin抗体(美国Abcam公司);总蛋白提取试剂盒(美国Pierce公司);Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司);健康清洁级大鼠(武汉科技大学实验动物中心提供)。1.2动物分组及观察时相点SD健康大鼠60只,雌雄不限,鼠龄6个月,体质量(220±20)g,随机分成对照组和治疗组,每组30只动物,每组观察时相点为术后1、7、14、21及28d,每时相点6只动物。1.3治疗大鼠髓炎用3%戊巴比妥钠按1mL/kg腹腔麻醉大鼠,常规脱毛消毒铺巾,以大鼠T12为中心背正中切口,咬除T12椎板,暴露T12脊髓,按照Allen’s打击法复制脊髓损伤模型,治疗组在伤后15min经腹腔注射参芎葡萄糖注射液30mL/kg,对照组经腹腔注射等量生理盐水。1.4脊柱损伤后下肢运动功能的评估1.4.1bbb评分法评估脊柱损伤后的后足部运动功能1.5髓中阳性表达细胞的检测各实验组大鼠分别于术后第1、7、14、21、28d在戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉下用4%多聚甲醛经心插管灌注固定,取出以损伤脊髓为中心长约1cm脊髓组织,一部分脊髓供免疫印记法使用,一部分常规石蜡包埋,连续切片,切片厚度7μm,每实验组选取脊髓组织切片各6张,GAP-43和NF200染色各3张,按SABC试剂盒说明书进行操作,DAB显色,苏木素复染,中性树脂封片保存。染色结果判定:胞浆胞核呈棕黄色为阳性细胞,根据抗体不同可分别确定为GAP-43或NF200阳性表达细胞。染色玻片在200倍显微镜下观察拍照,每张切片随机选取3个不重复视野,计算3张玻片9个高倍视野的平均阳性细胞数代表该标本的阳性神经细胞数并进行方差分析。1.6小鼠nf200单克隆抗体的制备用天平称取50mg左右的组织,按照总蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白质,按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度后制备蛋白样品,取40μg等量蛋白样品经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)分离NF200(35kD)和GAP-43(43kD)后,经电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭后加一抗:小鼠抗大鼠NF-200单克隆抗体(1∶600)或小鼠抗大鼠GAP-43抗体(1︰600)或鼠抗β-actin(1︰600),4℃过夜,洗膜,加入二抗山羊抗小鼠IgG-HRP(1︰10000稀释度),室温孵育1h,洗膜后加入DAB显色液反应1min,暗室曝光显影后冲洗胶片,于凝胶成像分析系统上摄像分析扫描。以β-actin作为内参,测定各泳道NF-200或GAP-43蛋白条带光密度,以目的条带光密度值与同一样本内参为β-actin光密度值的比值来表示,进行半定量分析。1.7相关分析以治疗组运动功能BBB评分、免疫组织化学检测GAP-43和NF200阳性表达细胞数进行Pearson相关性检验。1.8统计学处理方法采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析,所有计量资料以均数±标准差(ue0af±s)表示,均数间差异采用方差分析,相关性采用Pearson检验,P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠的运动功能恢复2.1.1as-b运动功能评分的比较2.2两组阳性细胞表达比较各时点GAP-43和NF200免疫组织化学染色阳性细胞数量见表2,两组大鼠脊髓损伤后第1天仅有少量GAP-43和NF200阳性细胞表达且染色淡,治疗组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),以后逐渐增多,7d时达高峰,GAP-43和NF200免疫组织化学染色阳性细胞数最多,着色深。随后逐渐下降,对照组21d下降至低于初始水平,而治疗组仍维持较高水平,治疗组明显高于对照组(P<0.05),说明脊髓损伤后参芎葡萄糖注射液可以明显上调GAP-43和NF200的表达。见图3~6。2.3两组治疗组和对照组的光密度比较免疫印迹法测定结果见图7~9。β-actin条带清晰一致,表明蛋白样品一致。在脊髓损伤后1d治疗组GAP-43和NF200阳性条带相对平均光密度值较对照组差异不大(P>0.05),以后差异增大,7d时差异最明显(P<0.05),随后下降,但治疗组14d仍维持较高水平,28d时仍高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.4gf2004表达与ga-33和nf200表达的关系SCI后随着时间延长,7d和14d时运动功能恢复BBB评分与GAP-43和NF200阳性细胞数量呈正相关(P<0.05),1d以后GAP-43阳性细胞数量与NF200阳性细胞数量持续呈正相关(P<0.05),说明脊髓损伤后运动功能恢复与GAP-43和NF200表达有密切关系,GAP-43和NF200表达程度高,脊髓运动功能则恢复得快。见表3。3连接胞膜磷酸蛋白的单次给药对特殊患者髓内再生的特殊机制的治疗SCI分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是指直接的机械性损害造成的局部神经组织的破坏。继发性损伤是原发性损伤后立即发生的进行性病理生理变化,主要包括脊髓出血、水肿、微循环障碍等,这些病理生理变化加重了脊髓的损害,最终导致原发性损伤后存留的神经细胞固缩退变、消失,轴突及髓鞘退变形成空泡,神经功能减退,继发性损伤是SCI后功能恢复的主要障碍。多年来,研究者不断寻找各种减轻SCI和促进神经功能恢复的手段。研究发现,在发育成熟的中枢神经系统中,成熟神经元轴突的生长和突触的可塑性处于抑制状态。当轴突受到损伤后,轴突的延长和重构可以被重新诱导,诱导与神经轴突向外生长依赖相关蛋白的合成,GAP-43和NF200的合成就是其中之二。GAP-43在神经元发育、再生以及突触可塑性变化中具有非常重要的作用,GAP-43是内源性神经元生长依赖的快速转运胞膜磷酸蛋白,主要分布于神经元、再生的施万细胞和神经胶质细胞,与神经发育、轴突再生、突触可塑性密切相关,在神经元发育和神经再生过程中,GAP-43在神经元胞体内大量合成后很快运送到轴突,在生长锥、轴突及突触前末梢大量表达,通过加速生长锥基部胞膜的扩展而促进轴突分支、伸长,调节生长锥及突触形态,参与神经元损伤后轴突再生和突触重构过程,当神经再生完成后,GAP-43又恢复到正常水平。因此,GAP-43被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子和神经元损伤后再生的标志性蛋白。神经丝蛋白(NF)是构成神经元胞体和神经轴突细胞骨架的主要成分,在维持神经元细胞独特的形态特征和神经系统正常活动所必须的轴浆运输、大脑发育以及神经元再生和可塑性方面发挥着重要作用。NF按相对分子质量的不同,可分为NF68、NF140和NF2003种。其中NF200在正常情况下只存在于轴索中,而胞体不含有或很少含有。大量研究发现,当脊髓损伤后,损伤区神经元在创伤刺激及多种诱导因子的作用下,诱导损伤区GAP-43和NF200大量合成及积存,以适应神经再生的需要[10，12]。本研究选用腹腔注射参芎葡萄糖注射液治疗大鼠急性脊髓损伤,并与对照组进行比较。结果显示,1参芎葡萄糖注射液可以提高脊髓运动功能的评定,对脊髓损伤后脊髓运动功能的恢复有一定的促进作用。2SCI后GAP-43和NF200阳性神经元的表达1d以后开始增多,7d左右最明显且神经元体积增大,胞浆着色加深,以后逐渐下降,与相关报道一致[8，11]。给予参芎葡萄糖注射液干预的实验组GAP-43和NF200阳性神经元比对照组表达增多更为明显。3大鼠脊髓不完全损伤后后肢运动功能的恢复(BBB评分和斜板试验)与脊髓中GAP-43和NF20含量变化的趋势较一致,损伤后7d和14d呈正相关,提示GAP-43和NF200的含量变化可能与脊髓挫伤后的可塑性有关。4GAP-43与NF200阳性神经元的表达有一定的相关性。以上表明参芎葡萄糖注射液能够促进损伤脊髓运动功能恢复,其机制可能是通过上调损伤脊髓神经元合成更多的GAP-43和NF200而实现。本研究初步观察了参芎葡萄糖注射液在神经元生长方面的活性作用,为进一步研究参芎葡萄糖注射液的作用机制提供了基础,也为其用于临床脊髓损伤治疗提供实验依据。分别于损伤后1、7、14、21和28d将各组动物置于7cm高、直径90cm的平坦不滑的塑胶模板上,根据BBB评分法对损伤后动物后肢功能进行评分。1.4.2不同治疗组髓损伤术后运动能力及恢复效果比较采用RIVLIN等建立的斜板试验对大鼠后肢功能进行评分。大鼠放置于垫有橡胶垫的自制斜板上,身体纵轴与斜板纵轴平行,头朝斜板抬高侧,倾斜角度从0°开始缓慢上升,每次升高5°,以能停留5s不滑下的最大角度来评分。分别于损伤后1、7、14、21和28d测量两组大鼠抓握能力和维持姿势的能力,重复3次取平均值。正常肢体运动评分为21分,分值最高且稳定无变化。本实验结果显示对照组和治疗组脊髓损伤后1d的评分均显著降低,比较两组BBB评分差异无统计学意义(P>0.05)。随着损伤时间延长两组均有不同程度的恢复,但治疗组恢复效果较对照组明显,差异有统计学意义(