高效液相色谱法分离唑来膦酸及其有关化合物

高效液相色谱法分离唑来膦酸及其有关化合物

偶氮磺胺是咪唑的一种第三代双黄酮类药物，主要用于治疗恶意高钙血症。没有关于色度成像的报告。本文采用反相离子对高效液相色谱研究了唑来膦酸及其有关化合物(包括其合成过程中残余的原料咪唑乙酸和其他氧化分解产物)的色谱分析方法,为该药提供了一种可靠的分析手段。双膦酸类药物(包括双膦酸和双膦酸盐)是一类含有P—C—P键的化合物,含有两个膦酸基团,因而极性太强,不能在C8、C18等非极性色谱柱上保留,其色谱分析方法多采用离子交换高效液相色谱法。双膦酸类化合物是四元酸,存在多级电离,在离子交换高效液相色谱法中为了保证它们以单一的电离形式保留,需要采用强碱或强酸性流动相,因而这些方法大多以价格昂贵的耐强碱或耐强酸的阴离子交换柱作为固定相,且需要梯度洗脱,分离效果及重现性差,操作繁琐耗时,分析成本高,难以在药品的常规分析中应用。本文所建立的反相离子对高效液相色谱法,通过在流动相中加入离子对试剂四丁基溴化铵,使得唑来膦酸及其有关化合物在反相色谱柱上保留,通过优化色谱条件,采用等度洗脱方式便达到了很好的分离。方法可靠,不需要复杂的样品处理过程,适用于唑来膦酸原料药、制剂的常规检验以及有关化合物的检测。1实验部分1.1气相色谱-质谱ro液相色谱仪系统包括SP8810型输液泵、SP8450型紫外-可见检测器(美国光谱-物理公司)、HW-2000色谱工作站(南京千谱软件有限公司);Rheodyne7125i型六通进样阀。唑来膦酸、咪唑乙酸均由河北医科大学药学院提供;四丁基溴化铵、磷酸二氢钠均为分析纯试剂;试验用水均使用二次重蒸水;甲醇为色谱纯试剂。1.2流动相、检测波长色谱柱:HypersilC8柱(150mm×4.6mmi.d.,5μm)(大连依利特科学仪器有限公司)。流动相:甲醇-5mmol/L磷酸二氢钠缓冲液(含6mmol/L四丁基溴化铵溶液,用氢氧化钠溶液调节pH至7.0)(体积比为20∶80),流速:1.0mL/min。检测波长:220nm。进样量:20μL。柱温:室温。2结果与讨论2.1流动相ph值及甲醇体积分数对相来膦酸峰形的影响分别以HypersilC8和HypersilC18柱作固定相,考察磷酸二氢钠缓冲液浓度(5mmol/L)、流动相pH值(7.0)及甲醇的体积分数(20%)一定时,增加流动相中离子对试剂(同时有减尾剂的作用)四丁基溴化铵浓度对唑来膦酸峰形的改善情况。结果显示,以HypersilC18作固定相,唑来膦酸的峰形较差且难以改善;而以HypersilC8作固定相,增加离子对试剂浓度,峰形得到明显改善,能够满足要求,因此最终以HypersilC8柱作为固定相。2.2数及缓冲液浓度流动相的pH值、离子对试剂浓度、有机改性剂的体积分数及缓冲液浓度对唑来膦酸及其有关化合物(主要指咪唑乙酸)的保留行为有较大的影响。为了获得最佳的分离效果,我们研究了这些因素对其色谱行为的影响,结果见图1。2.2.1ph值的确定唑来膦酸为四元有机酸,其水溶液显酸性(体积分数为0.7%的唑来膦酸水溶液的pH值约为2.0);相对于酸性较强的唑来膦酸而言,其合成原料的残留咪唑乙酸是一种非常弱的酸,因此要同时使唑来膦酸和咪唑乙酸在离子对色谱中保留,并使唑来膦酸与其有关化合物得到良好的分离,关键是选择合适的pH值。当四丁基溴化铵浓度(6mmol/L)、磷酸二氢钠缓冲液浓度(5mmol/L)及甲醇的体积分数(20%)一定时,在pH4.0~7.5范围内,流动相pH值对唑来膦酸和咪唑乙酸的保留行为的影响见图1-a。由图1-a可知,随着流动相pH值的增加,二者的保留都增加;当pH≥7.0时,咪唑乙酸的保留因子k>1,说明只有在较高pH条件下咪唑乙酸才以阴离子状态存在,从而可以和四丁基铵阳离子形成中性离子对,在C8柱上得到良好的保留。兼顾到合适的保留时间与良好的分离情况,最终选择pH7.0作为分离条件(当pH>7.0时,流动相对C8柱的损害较大)。2.2.2l时对四丁基溴化铵保留行为的影响当磷酸二氢钠缓冲液浓度(5mmol/L)、流动相pH值(7.0)及甲醇的体积分数(20%)一定时,离子对试剂四丁基溴化铵浓度为0~8mmol/L时对唑来膦酸和咪唑乙酸保留行为的影响见图1-b。由图1-b可以看出,随着四丁基溴化铵浓度的增加,二者的保留都呈现出增加的趋势。当四丁基溴化铵浓度大于5mmol/L时,唑来膦酸保留增加的趋势趋于缓慢。同时四丁基溴化铵浓度的增加改善了唑来膦酸峰形的拖尾,说明四丁基溴化铵也起到了减尾剂的作用。考虑到唑来膦酸和咪唑乙酸的保留行为和峰形情况,最终选择四丁基溴化铵的浓度为6mmol/L,在此条件下,二者的分离良好,唑来膦酸峰的拖尾因子为1.05。2.2.3甲醇体积分数的影响当四丁基溴化铵的浓度(6mmol/L)、磷酸二氢钠缓冲液浓度(5mmol/L)及流动相pH值(7.0)一定时,加入体积分数为5%~25%的甲醇,考察其对唑来膦酸和咪唑乙酸保留行为的影响(见图1-c)。结果发现,随着甲醇体积分数的增加,流动相的极性减小,洗脱能力增强,唑来膦酸和咪唑乙酸的保留均减弱。兼顾到合适的保留时间与良好的分离,最终选择甲醇的体积分数为20%。2.2.4样品前进样的制备在6mmol/L四丁基溴化铵、pH7.0及20%甲醇条件下,浓度为5~50mmol/L磷酸盐(磷酸二氢钠)缓冲液对唑来膦酸和咪唑乙酸保留行为的影响见图1-d。由图1-d可知,随着磷酸盐缓冲液浓度的增加,二者的保留均减弱。为了保证良好的分离及合适的保留时间,最终选择磷酸盐缓冲液的浓度为5mmol/L。研究结果表明,在上述优化的分离条件下,唑来膦酸与其有关化合物有合适的保留时间并有较好的分离。图2为该条件下,采用HypersilC8色谱柱得到的唑来膦酸(图2-a)、咪唑乙酸(图2-b)、注射用唑来膦酸(图2-c)、唑来膦酸注射液(图2-d)、经氧化破坏的唑来膦酸样品(图2-e)及经紫外灯(40