自然发酵泡菜中共轭亚油酸高产菌株的筛选及培养基优化

自然发酵泡菜中共轭亚油酸高产菌株的筛选及培养基优化

随着生活水平的提高，人们越来越关注自己的健康，食品的安全和营养越来越受到重视。共轭亚油酸(CLA)作为一种重要的营养物质,在人体和动物健康方面的作用正日益受到关注,并逐渐成为生物保健和疾病治疗研究的新热点和新领域,被世界公誉为“21世纪的新型营养素”。目前,世界上仅有少数国家生产出以CLA为原料的保健食品。美国的SmartbodyNutrition、JarrowFormulas和ASTSportScience等公司已推出CLA软胶囊丸保健品,日本则推出了以CLA为主要活性成分的高效减肥保健品,这些产品在欧美及日本市场非常畅销。目前工业上主要是采用化学合成法生产CLA,如碱法异构化,使亚油酸(LA)发生异构化而生成CLA。但化学合成法存在较多缺点,如CLA产物中异构体繁多、有毒成分残留、分离纯化工艺复杂、生产成本高等。许多微生物能够利用自身的酶将LA转化成CLA。与化学合成法相比,利用微生物合成CLA的特异性强,条件温和,产物中活性CLA异构体含量高,对人体无毒副作用。因此利用微生物生产CLA已成为主要的研究方向。乳酸菌兼性厌氧,培养条件易于控制,无毒安全。迄今,人们发现多种乳酸菌菌种可以发酵生产CLA。Ogawa等研究发现,嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)AKU1137在微好氧的环境下,可将LA转化为CLA。Irmak等对嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)ATCC23272和ATCC55739进行研究,发现这3种菌都有将LA转化为CLA的能力。自然发酵的泡菜汁中富含乳酸菌,笔者通过溴甲酚紫平板筛选产酸细菌,革兰氏染色法初步鉴定,紫外吸收光谱法检测发酵液中CLA含量等方法,从3种自然发酵的泡菜中筛选出一株共轭亚油酸高产菌株QL2,并对其培养基组成成分及底物亚油酸添加量进行了优化。1材料和方法1.1试验材料1.1.1原料：本地泡菜、海里泡菜和泡菜1.1.2化学试剂及仪器共轭亚油酸标准品,(纯度≥96%,Sigma公司);亚油酸(分析纯,上海制剂一厂);吐温-80(化学纯,上海青析化工有限公司);溴甲酚紫(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);正己烷(分析纯,天津市大茂化学试剂厂)。1.1.3主要仪器。SK-1快速混匀器(常州国华电器有限公司);150A型生化培养箱(富华电器有限公司);YXO-GOI-280型蒸汽灭菌锅(上海医疗器械厂);FA1004型电子天平(上海天秤仪器厂);BCD-238低温冰箱(博西华家用电器有限公司);UV751GD紫外/可见分光光度计(上海分析仪器厂);VD-650桌上式垂直送风洁净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)。1.1.4培养基分离纯化培养基:溴甲酚紫平板培养基;斜面保藏培养基:MRS固体培养基;初始发酵培养基:MRS液体培养基。1.2测试方法1.2.1正己烷-正己烷分光光度法检测cla标准溶液吸收值取2.5mgCLA标准品以正己烷为溶剂定容于25ml容量瓶中,分别吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80ml装入容量瓶,定容至10ml。将CLA标样配成不同浓度的溶液,以正己烷为参比,在波长233nm处测定其吸收值。以CLA浓度(μg/ml)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制CLA紫外吸收标准曲线。1.2.2干燥器的培养采用烛缸法。即将已接好种的平皿或者试管放入密闭干燥器内,干燥器中放置点燃的蜡烛,立即盖上器皿盖,待蜡烛熄灭后,将干燥器置于生化培养箱中培养。1.2.3制备“x”汁和“快速”匀液的制备按吐温-80∶LA为5∶3的比例混合,加入10ml蒸馏水,然后用快速混匀器混匀。LA乳化液采用膜孔径为0.22μm的微孔过滤器过滤除菌,然后按一定比例加至已灭菌的发酵培养基中。1.2.4菌落的分离纯化在无菌条件下,取3种自制泡菜样品的发酵汁在溴甲酚紫平板上划线,37℃恒温培养48h,对其中产生黄色圈的菌落进行反复分离、纯化至纯菌落。将各菌株编号,并将其接种于MRS固体斜面培养基上,培养48h后,置于4℃冰箱中保存,备用。1.2.5发酵液中cla的分离纯化将初筛菌株分别接种于装有MRS液体培养基的三角烧瓶中,37℃活化2代。在装有MRS液体培养基试管(4.5ml/管)中加入500μlLA乳化液并摇匀,使发酵培养液中亚油酸浓度为0.06%(V/V)。将已活化的初筛菌株接入含亚油酸初始发酵培养液中,接种量为2.00%(V/V)。37℃静置,发酵24h。发酵结束后,试管中的发酵液(5ml)移入60ml分液漏斗中,每管发酵液加入20ml正己烷振荡萃取。静置分层后放弃下层水相液体,加入等量蒸馏水振荡水洗,静置后弃去下层水相液体,水洗2遍后,萃取液移至干净小烧杯中,加入少量无水硫酸钠脱去萃取液中的水分和水溶性物质,干燥至无乳化层。将脱去水分和水溶性物质的正己烷萃取液移入25ml容量瓶中,加入正己烷定容,摇匀后待测。以未接入菌种,其他步骤和条件同上所得正己烷萃取液为对照组。将样品置200~350nm波长范围内扫描,观察波长233nm处有无特征吸收峰。在233nm波长处有特征吸收峰者,表明其发酵液中有CLA生成。读取233nm处的吸光度,根据吸光度-CLA浓度标准曲线所得CLA浓度、测定稀释倍数、萃取时正己烷与培养液体积比,计算发酵液中CLA的生成量。根据培养发酵液中CLA的含量,筛选出产CLA水平最高的菌株。1.2.6优化培养基组成的构成1.2.6.菌株的培养和接种分别以浓度为2.00%(V/V)的D-果糖、D-半乳糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖作为发酵培养基(4.5ml/管)的唯一碳源,底物LA添加量为0.06%(V/V)。将活化2代后的菌株QL2接种到已灭菌的发酵培养基中,接种量为2.00%(V/V)。在37℃的培养箱里静置发酵24h,检测发酵液中CLA的产量,以得到最优的碳源。1.2.6.培养基底物la添加量分别以浓度为3.00%(V/V)的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵和柠檬酸氢二铵作为发酵培养基(4.5ml/管)的唯一氮源,底物LA添加量为0.06%(V/V)。将活化2代后的菌株QL2接种到已灭菌的发酵培养基中,接种量为2.00%(V/V)。在37℃的培养箱里静置发酵24h,检测发酵液中CLA的产量,以得到最优的氮源。1.2.6.无机盐对cla表达的影响在亚油酸浓度和菌株QL2接种量不变,以及已优化了碳、氮源的MRS(未加无机盐)培养基的基础上,添加不同浓度的CH3COONa、K2HPO4和MgSO4,以发酵液中的CLA产量为检测指标,研究这3类无机盐对菌株QL2生成CLA的影响。选取正交表L9(34)安排正交试验方案,正交试验的因素和水平见表1。1.2.6.菌株的活化在优化后的发酵培养基(4.5ml/管)中,分别添加0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%、0.24%、0.28%、0.32%、0.36%、0.40%、0.44%、0.48%、0.52%、0.56%、0.60%(V/V)的LA。将活化2代后的菌株QL2接种到已灭菌的发酵培养基中,接种量为2.00%(V/V)。在37℃的培养箱里静置发酵24h,检测发酵液中CLA的产量,以得到最优的底物LA添加量。2结果与分析2.1标准cma紫外吸收曲线以CLA浓度(μg/ml)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制CLA紫外吸收标准曲线,如图1所示。2.2发酵液中cla和bl2的浓度检测从3种自制泡菜汁样品中分离出50株G+菌,经初步发酵检测后,有19株菌发酵液的萃取液在233nm处有最大吸收峰(图2),其中菌株QL2的发酵液CLA产量最高,达23.263μg/ml。2.3唯一碳源类型分别以2.00%(V/V)D-果糖、D-半乳糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖作为发酵培养基的唯一碳源,CLA产量依次为29.342、28.047、23.299、33.047、23.478、25.241μg/ml。可见,菌株QL2可以利用D-果糖、D-半乳糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖进行生长代谢,并将LA转化成CLA,当发酵培养基以乳糖为碳源时,CLA产量最高。2.4氮源中cla的产量以2.00%(V/V)乳糖为发酵培养基的碳源,分别以3.00%(V/V)蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵和柠檬酸氢二铵作为发酵培养基的氮源,CLA产量依次为31.824、33.622、24.270、24.054、33.371μg/ml。可见,菌株QL2可以利用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵和柠檬酸氢二铵进行生长代谢,并将LA转化为CLA,当发酵培养基以酵母膏为氮源时,CLA产量最高。2.5发酵液中cla的发酵条件以2.00%乳糖为碳源、以3.00%酵母膏为氮源,按照正交表L9(34)分别添加不同浓度的CH3COONa、K2HPO4、MgSO4于未加无机盐的发酵培养基中。由表2可知,影响发酵液中CLA产量的因素主次顺序为B>A>C,即K2HPO4>CH3COONa>MgSO4。在CH3COONa、K2HPO4、MgSO43种无机盐中,K2HPO4对CLA产量影响最为显著,3因素的最优水平为A1B3C3。即:CH3COONa0.20%,MgSO4·7H2O0.08%,K2HPO4·3H2O0.30%。2.6底物la浓度对cla产量的影响在优化碳、氮源和无机盐后的发酵培养基中,LA添加量分别为0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%、0.24%、0.28%、0.32%、0.36%、0.40%、0.44%、0.48%、0.52%、0.56%、0.60%(V/V)。由图3可知,当底物LA浓度低于0.40%(V/V)时,CLA产量随LA浓度的增加而升高,但转化率的提高并不明显。当底物LA浓度为0.40%(V/V)时,CLA产量最高,达到288.740μg/ml,转化率高达7.21%。当底物LA浓度超过0.40%(V/V)时,CLA产量随LA浓度增加而下降,转化率也随之显著下降。可能是过高浓度的LA对菌体的生长代谢有一定的毒性,从而降低了LA的转化及CLA产物的形成。3发酵液中cla和培养基的组成(1)从3种自制泡菜汁样品中分离出50株G+菌,经过初步发酵试验,其中19株菌发酵液的萃取液在233nm处有吸收值,它们产CLA的能力从3.982μg/ml到23.263μg/ml不等,其中菌株QL2的发酵液CLA产量最高,达23.263μg/ml。(2)对菌株QL2的培养基组成成分进行优化,得到发酵培养基的最优碳源是乳糖,最优氮源是酵母