不同运动方式和制动状态下大鼠腓肠肌p-ak蛋白表达的变化

不同运动方式和制动状态下大鼠腓肠肌p-ak蛋白表达的变化

骨肌肉合成改善的信号通道主要集中在igf-1的pi3k和gat-m-s通道上，这些运动刺激了igf-1的发现，促进了act（ser373）的激活。激活的agt使ser2448磷酸，促进蛋白质合成。另一方面,肌肉蛋白质降解可以通过四种途径来完成,包括溶酶体途径、calpain途径、caspase途径和泛素蛋白酶体途径,而泛素蛋白酶体途径是蛋白质结构和功能的主要调节者。肌肉萎缩时,泛素蛋白酶系统的多种组分表达都有升高,而泛素蛋白连接酶E3s是其中的关键环节。研究显示,两种E3与肌萎缩密切相关,分别是MAFbx/Atrogin-1和MuRF1。有研究显示,MuRF1和MAFbx两泛素蛋白连接酶(肌肉蛋白降解的重要标志)在肌肉出现萎缩的过程中表达增加。FOXO家族是转录调节因子,对细胞增殖、细胞凋亡等生理过程具有重要调节作用,肌萎缩时,PI3K/Akt通路受到抑制,而PI3K/Akt可对FoxOs特定的氨基酸位点进行磷酸化/去磷酸化的调控。当去磷酸化的FoxOs移入细胞核内,骨骼肌中的MuRF1和MAFbx表达上调,MuRF1和MAFbx通过编码E3泛素连接酶,从而加速蛋白降解,引起骨骼肌萎缩;过表达Akt会抑制FOXO和MAFbx的表达,当FOXO受抑制时,MAFbx表达下降,干扰肌萎缩的发生。由此可见,FOXO在肌萎缩发生中起重要作用。近几年的研究表明,该家族成员FoxO1在骨骼肌的分化、生长与代谢过程中扮演重要角色。IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号转导通路不仅可以直接使蛋白合成增加,而且磷酸化状态下的Akt,可以通过抑制FoxOs的转录而阻止MuRF1的表达,进一步加大骨骼肌肥大的发生效果。本文利用耐力训练、离心训练、后肢悬垂三种模型,研究不同运动方式对骨骼肌代谢的影响,通过对AKT、FoxO1、MuRF1等因子的研究,探讨骨骼肌蛋白质合成/降解的分子机制,从而为与运动相关的骨骼肌形态、机能改变的机理研究提供实验依据。1材料和方法1.1实验动物中心清洁级雄性SpragueDawley(SD)大鼠40只,体重(200±10)g,约8周龄,购自大连市大连医科大学实验动物中心。饲养条件:温度(20±2)°C、分笼饲养、自然昼夜节律变化光照、国家标准啮齿类动物饲料。1.2大鼠的运动方案动物实验方案获得辽宁师范大学伦理委员会的批准。将大鼠随机分为4组:对照组、耐力训练组、离心训练组、后肢悬垂组。每组10只。对照组:该组大鼠作为对照,不参加运动训练,自由饮食。耐力训练组:将跑台坡度设置为0°,第1~2周为渐增负荷的适应性训练,第3~12周正常训练,跑速为30m/min,60min/次,为中等运动强度,相当于70%~80%VO2max、1次/d,6d/周。后肢悬垂组:参照Chen等的大鼠尾部悬吊方案建立悬垂模型,使大鼠始终能够保持低头位(头部与地面成30º夹角),并且前肢能够自由活动;该组大鼠用50cm×50cm×50cm的鼠笼单独饲养,第1~8周大鼠放在笼子里饲养不参加活动,不做任何处理,第9~12周进行为期4周的后肢悬垂;在后肢悬垂实验中途,有2只鼠出现不适反应,被淘汰,最后本组剩下8只鼠。离心训练组:参照Bedford等的运动负荷方案:第1、2周为适应性训练,运动强度逐渐增加(跑台坡度由0º到-16º,跑台速度由10m/min逐渐增加到16m/min,训练时间逐渐增加),第3~12周进行正式训练,跑速16m/min,坡度-16º,45min/次,6d/周。为避免出现急性效应,大鼠停止训练2d后,在其处于禁食的状态进行实验取材。腹腔注射20%的氨基甲酸乙酯(俗称乌拉坦)进行麻醉。腹主动脉取血。迅速取出大鼠腓肠肌,立即储于液氮中保存备用。1.3免疫、免疫药物和抗PMSF、EDTA、溴酚蓝、TEMED、EGTA购置于AMRESCO公司;TritonX-100、BSA、Glycerol、Acrlamide-bis购置于ScientificResearchSpecial公司;APS、SDS、DTT、甲苯胺蓝、Tris-Base、Glycine购置于Biosharp公司;丙烯酰胺购置于NOVON公司。其它为国产分析纯。实验用抗体:抗兔FoxO1多克隆抗体(18592-1-AP,Proteintech公司);抗兔p-Akt单克隆抗体(BS4007,Liawaild公司);抗兔MuRF1多克隆抗体(55456-1-AP,Proteintech公司);抗兔β-actin(C4)单克隆抗体(sc-47778,SantaCruz公司);免疫组化用羊抗兔二抗(SP-9001,北京中杉金桥生物技术有限公司)。Westernblot用羊抗兔二抗(31460,Thermo公司)。1.4免疫组织化学染色法dab免疫组化:一抗抗兔单克隆抗体p-Akt参照预实验结果按1:50稀释,室温静置备用。阴性对照用PBS代替一抗。组织切片二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化;3%H2O2溶液室温孵育20min;0.01mol/LCB缓冲液(pH6.0)滴加组织,微波修复100°C(P6火力)25min,自然冷却,PBS常温浸泡3min×3次;室温下滴加胎牛血清(Gibco公司)封闭15min;37°C环境结合一抗1h,4°C孵育过夜,PBS浸泡3min×3次;加二抗,37°C孵育20min,PBS浸泡3min×3次;酶标羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)与一抗在37°C下结合20min,PBS浸泡3min×3次;新鲜配制DAB显色;苏木精复染胞核,透明并封固。免疫组化结果根据阳性细胞分布、阳性细胞数和染色强度综合判断,以细胞膜上清晰的黄褐色颗粒为判定阳性标准。用Imagepro6.0软件对切片在400倍下拍照获得的图像进行分析,测得不同切片的光密度值。1.5染色、照片的制备石蜡切片脱蜡至水;苏木素染色2min;流水返蓝10min;伊红染色1min;流水冲洗2min;梯度乙醇脱水、透明;封片。将染色后切片在400倍下拍照获得图像。用Imagepro6.0软件对切片在400倍下拍照获得的图像进行分析,测量出细胞的平均横截面积。1.6上样和上样制备取腓肠肌称重、剪碎,每克组织加3mLRIPA裂解液[NaCl终浓度0.15mol/L,TritonX-100终浓度1%,Deoxycholow脱氧胆酸钠终浓度1%,SDS终浓度0.1%,Tris-HCl(pH=7.4)终浓度10mmol/L,使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF终浓度为1mmol/L],匀浆,静置40min充分裂解,10000r/min离心10min,取上清,Bradford法定蛋白,分装,以上操作均在4ºC进行,蛋白分装后置于-80ºC冰箱储存备用。电泳时,取80μg总蛋白配制成上样体系,置95°C沸水中5min,上样前以3000r/min离心5min。配制8%分离胶(MuRF1、FoxO1)、12%分离胶(β-actin),4%浓缩胶,220V电压进行电泳,半干转膜仪220V转移90min将蛋白转到PVDF膜上,封闭60min后加入一抗(MuRF11:500、FoxO11:400、β-actin1:1000),4°C孵育过夜,PBST洗膜后用不同浓度二抗室温孵育60min,ECL显色、定影,凝胶成像系统进行拍照,GelPro32图像分析系统分析结果,将每个条带与相应样品的β-actin条带光密度值进行比较,计算出目的条带的相对含量值。1.7统计学处理实验数据用mean±SD表示,采用SPSS18.0统计软件进行多因素方差分析统计,两两比较用LSD法或Tamhane’sT2法(方差不齐),P<0.05显示为有统计学差异。2结果2.1大鼠体重和体重的变化由图1可见,从第9周开始,各组大鼠体重的改变出现了差异,至第12周时,耐力训练组、离心训练组和后肢悬垂组大鼠体重均低于对照组,且后肢悬垂组体重最小。离心训练组和后肢悬垂组大鼠腓肠肌重量较对照组均显著下降(P<0.05或P<0.01),耐力训练组与对照组比较无显著性差异(表1)。2.2组患者截面积、企业被截面积、关于被压迫力对比见表1由图2所示,离心训练和后肢悬垂组腓肠肌细胞横截面积显著低于对照组(P<0.05或P<0.01),耐力训练组与对照组比较无显著性差异。肌细胞横断面积的变化与腓肠肌重量的改变相一致。2.3提高了腓肠肌p-akt蛋白表达由图3显示,和对照组相比,耐力训练和离心训练这两种运动方式均极显著提高了大鼠腓肠肌p-Akt蛋白表达(均P<0.01),而制动的模型后肢悬垂没有引起p-Akt表达的明显改变。2.4在氧漂后离心运动和抗性训练中明显提高merf1蛋白表达由图4显示,和对照相比,后肢悬垂明显增加了大鼠腓肠肌MuRF1的表达(P<0.05),离心运动极显著提高了MuRF1表达(P<0.01),耐力训练没有显著改变MuRF1蛋白表达。如图4所示,耐力训练非常明显降低了大鼠腓肠肌FoxO1蛋白表达(P<0.01);而后肢悬垂和离心运动均显著提高了腓肠肌FoxO1表达(P<0.01)。3离心运动与免疫骨骼肌对运动训练等相关刺激有高度的敏感性,运动的刺激能够引起骨骼肌蛋白质的合成与分解代谢发生改变,表现在肌肉质量和横截面积大小以及重量的变化上。耐力训练可选择性激活AMPK,活化的AMPK能磷酸化激活TSC2,并促进TSC1/2复合物的形成,后者通过抑制Rheb的活性,间接抑制mTOR的活性,从而减少骨骼肌蛋白质的合成。本研究结果显示,耐力训练组腓肠肌重量较对照组无显著差异,这可能是由于耐力训练促进Akt磷酸化,同时激活了AMPK两个信号分子,从而对mTOR的作用相互抵消,使得耐力训练组与对照组无显著差异。本研究结果显示耐力训练引起p-Akt的蛋白表达显著升高,这验证了上述推断。而耐力训练组大鼠体重增幅低于对照组大鼠,这可能是长期进行耐力训练,使体内脂肪减少,从而使体重较轻的缘故。Hyldahl等报道,大鼠经离心训练以后,骨骼肌的蛋白降解率均有所增加。与这一结果一致,在本研究中,离心训练组腓肠肌重量及细胞横截面积呈现显著下降表现为离心训练组大鼠在12周时的体重增幅低于对照组。本研究结果显示,离心训练组和后肢悬垂组均引起了泛素蛋白酶途径活化。另外,连续的离心运动训练还可导致骨骼肌中钙依赖性蛋白酶(Calpain)含量的增加,Calpain可水解多种骨骼肌骨架蛋白,进一步导致肌肉结构和功能改变以及肌肉损伤,引起肌肉重量及横断面积的减少。另外,研究提示,在后肢悬垂情况下骨骼肌蛋白分解较蛋白合成更容易,后肢悬垂减少肌纤维蛋白合成率约为27%~40%。上述过程也可能导致离心训练组和后肢悬垂组大鼠在12周时的体重增幅低于对照组。Ma等研究1次耐力运动对Akt-mTOR信号通路的影响,观察到AktSer473磷酸化水平在运动后各时间点均显著升高。Cao等的研究显示,持续7周的耐力训练可以使p-PKB(p-Akt)蛋白表达显著升高,同时PKB(Akt)基因表达也显著升高。本研究结果和上述研究一致,显示经过12周耐力训练,大鼠腓肠肌p-Akt表达显著升高。此外,有研究显示,低强度有氧运动能够改善IGF-1/PI3K/Akt信号转导通路的磷酸化水平。本实验中耐力训练组腓肠肌FoxO1蛋白表达极显著低于对照组,而此组MuRF1与对照组无显著性差异,表明耐力训练方式对主导萎缩的因子无影响。验证了“激活状态下的Akt可以通过抑制FoxO1的转录而阻止MuRF1表达”的论断。本实验中,离心运动组p-Akt表达显著增加。出现这一结果的可能原因为,离心运动导致骨骼肌损伤,损伤修复过程激活了IGF-1/PI3K/Akt等蛋白合成的信号通路,使p-Akt表达显著增加。Eliasson等比较了离心运动和向心运动对Akt/mTORCI/p70S6K通路激活的影响,发现离心运动比向心运动能更有效地激活这一通路,并认为这是由于离心运动能使肌纤维产生更大的张力,对肌肉给予了更大的刺激。Roschel等研究了不同速度的离心运动对Akt/mTOR/p70S6K通路的影响,观察到完成了5组重复8次的离心展膝练习2h后Akt和p70S6K磷酸化表达均显著提高,并没有显示出速度差异性,因此认为影响蛋白合成的主要因素是肌肉所承受的张力而非速度。在本研究中,离心训练组腓肠肌FoxO1和MuRF1表达均显著升高,说明FoxO1表达升高可能激活了MuRF1的表达,表现在形态学指标的肌纤维横截面积也显著减小,考虑到离心训练组p-Akt表达同样显著增加,本文结果提示:长期的离心运动可能同