粉防己碱的生物活性及对肝纤维化及肠易激综合征的影响

粉防己碱的生物活性及对肝纤维化及肠易激综合征的影响

防止承认碱是千金藤科植物防止秘密行为的主要活性成分，化学结构属于异羟色胺类化合物。近年来,国内外对其药理作用机制进行了较为广泛的研究。资料表明,Tet具有多种生物学效应,在治疗纤维化、门静脉和肺动脉高压,免疫机能调节及肿瘤防治等方面具有很好的应用前景。1基本药物机制1.1tet的调节作用Ca2+信号传导异常,细胞浆Ca2+浓度升高是多种疾病的病理生理基础。Tet通过抑制细胞外Ca2+内流,干预细胞内Ca2+分布,维持细胞内Ca2+稳态,从而阻断有关病理过程。利用膜片钳记录技术表明Tet可剂量和时间依赖性地阻滞嗜铬细胞膜电压依赖性Ca2+通道,较高浓度Tet(1×10-4mol·L-1)可抑制诱生肌醇三磷酸(inositoltrisphosphate,IP3)药物引起的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞内Ca2+动员;而在较低浓度时(1×10-5mol·L-1)即可阻滞高浓度K+(3×10-2mol·L-1)诱导的细胞浆Ca2+浓度持续性升高和部分抑制缓激肽诱导的细胞浆Ca2+升高。我们研究结果表明Tet在阻断肝细胞外Ca2+内流的同时,还可促进线粒体对Ca2+的摄取、抑制线粒体Ca2+动员;但在维持肝细胞内Ca2+稳态过程中,阻断Ca2+内流起着主要作用。Tet对于静止期神经胶质瘤细胞浆内Ca2+浓度无明显影响,但可剂量和时间依赖性地抑制毒胡萝卜素(bombesin)及铃蟾肽(thapsigargin,TG)导致IP3积聚和细胞内Ca2+动员,降低Ca2+浓度升高峰值和持续时间。Bickmeyer等研究发现5×10-2mol·L-1KCl处理1min可使神经胶质瘤细胞系108-15细胞内Ca2+浓度一过性升高,1×10-4mol·L-1Tet预处理7min后再给予同样浓度的K+以去极化,Ca2+内流则被阻断。缓激肽可通过激活第二信使IP3诱导细胞内储存Ca2+释放,1×10-4mol·L-1Tet预处理7min可显著下调NG108-15细胞对缓激肽的反应,Tet还能够显著抑制血管紧张素Ⅱ诱导细胞内IP3生成及Ca2+释放,提示Tet除阻滞细胞膜电压门控通道介导的Ca2+内流外,还可通过阻滞受体门控通道干预细胞内Ca2+分布。1×10-4mol·L-1Tet能够阻滞毒胡萝卜素诱导NIH/3T3纤维母细胞和腮腺腺泡细胞Ca2+内流,但不能抑制抗CD3抗体OKT3或TG诱导白血病T细胞Ca2+内流;能够阻断HL-60细胞非电压门控Ca2+通道的激活,但可诱导细胞内Ca2+动员。Xuan等用荧光指示剂Fura-2/AM观察到谷氨酸盐、血清素及组织胺可剂量依赖性的诱导视网膜细胞外Ca2+内流,3×10-5mol·L-1Tet可使上述3种物质诱导Ca2+内流分别减少28%、46.8%和29%;但在无Ca2+培养液中,Tet不能阻滞血清素和组织胺诱导的视网膜细胞内Ca2+升高,结果说明Tet可通过N-甲酰D-门冬氨酸、血清素及组织胺(H1)受体调控的Ca2+通道阻滞Ca2+内流,但对视网膜细胞内Ca2+释放无明显影响。由此可见,Tet对不同组织类型细胞Ca2+通道阻滞的作用机制不同,可分别或同时阻滞电压门控通道和受体门控通道,且可激发某些肿瘤细胞内Ca2+动员,升高细胞内Ca2+浓度。1.2小鼠骨髓中nf-b的表达临床上,植物粉防己常被用于治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病,其主要生物活性成分Tet具有很强的免疫调节功能。研究表明Tet通过下调T细胞蛋白激酶C信号转导通路,抑制T细胞增殖,减少IL-2的分泌及下调T细胞激活抗原CD71的表达,这一作用与Ca2+通道阻滞无关。Shen等发现10-7～10-5mol·L-1Tet可显著抑制N-甲酰基蛋氨酰亮氨酰苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine)、氟波醇豆蔻酸盐乙酸酯(phorbol-myristate-acetate,PMA)诱导嗜中性白细胞巨噬细胞趋化蛋白-1表达上调、自由基聚集及对纤维蛋白原粘附。10-7～10-4mol·L-1Tet可剂量和时间依赖性地引起小鼠腹腔巨噬细胞、豚鼠肺巨噬细胞和小鼠巨噬细胞样细胞系J774细胞活性丧失;能够抑制巨噬细胞呼吸爆发,减少氧自由基的生成,下调多种炎性细胞因子的合成与释放。核转录因子NF-κB的激活与致炎因子的表达呈正相关。Tet可剂量依赖性抑制内毒素、PMA及二氧化硅诱导肺泡巨噬细胞NF-κB的激活及NF-κB依赖报告基因(reportergene)的表达,但对核转录因子Sp-1的DNA结合活性及Sp-1依赖报告基因的表达无影响,这一作用与抑制IκB降解的某些信号转导通路、清除羟自由基有关。1.3tet的诱导Lai等发现Tet时间和剂量依赖性抑制人白血病细胞系U937增殖及细胞克隆形成,其最适浓度为2.5×10-6mol·L-1。光镜下可见细胞形态具有凋亡特征,凝胶电泳见DNA梯形条带,同时流式细胞仪检测发现U937细胞具有磷脂酰丝氨酸外翻。结果提示Tet可通过非Ca2+依赖途径诱导U937细胞凋亡。Tet可剂量依赖性地抑制人白血病HL-60细胞增殖。镜下见细胞膜皱缩,凋亡小体形成;凝胶电泳可见清晰的DNA梯形条带。Tet处理BM13674细胞8h后即可见细胞凋亡形态特征和典型DNA梯形条带形成,作用较糖皮质激素更加迅速。可被磷脂酸合成酶抑制剂冈田酸(okadaicacid)所阻断;表明其作用机制可能为转录后蛋白质修饰。1.4tet的糖活肿瘤细胞MDR是影响癌症化学治疗效果的关键所在,其主要机制之一是细胞膜P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)过度表达。P-gp是一种细胞膜转运蛋白,可把抗癌药物泵出肿瘤细胞,降低细胞内药物浓度;最终导致抗肿瘤药物的细胞毒性下降。研究表明非细胞毒浓度的Tet可以增加阿霉素(doxorubicin,Dox)对三尖杉酯(harringtonine)耐受HL-60细胞生长的抑制,集落形成抑制率增加300倍,阻滞于G2M期的细胞比率增多,细胞内Dox聚集增加;但Tet不能增加Dox敏感HL-60的细胞毒性。Choi等发现3×10-6mol·L-1Tet可使paclitaxel对P-gp阳性HCT15细胞的半数抑制浓度下降3100倍,Dox的半数抑制浓度下降36倍;但对P-gp阴性的SK-OV-3细胞,Tet不能增加上述药物的细胞毒性。上述资料提示Tet可通过调节P-gp增强MDR相关性药物的细胞毒性。此外,Tet还可抑制血小板聚集及释放血小板因子,抑制血栓素TXB2的形成及磷脂酶A2激活,从而减少血栓的形成;阻断血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)促细胞增殖,抑制DNA合成,同时可使抑癌基因p53的表达增强,可能是一种诱导分化剂。2预防和控制dea的疾病2.1tet的表达Chen等观察了Tet对四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)致肝细胞损伤的影响。结果发现,与对照组相比,1×10-9～1×10-6mol·L-1Tet可使肝细胞膜的流动性增加71%～89%,乳酸脱氢酶释放和丙二醛(malondialdehyde,MDA)形成显著减少;细胞内Ca2+浓度降低,提示Tet可能通过阻断Ca2+内流、清除自由基达到保护肝细胞作用。给予大鼠硫唑嘌呤(azathioprine,Aza)25mg·kg-1·d-1,静脉注射2wk,可使血清转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、碱性磷酸酶(alkalinephospahatase,AKP)、MDA显著增高;还原型谷光甘肽(reductiveglutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)降低;肝组织病理变化显著。在给予Aza同时给予Tet30mg·kg-1·d-1,治疗组动物血清ALT、AKP、MDA、GSH、SOD与正常对照组无明显差异,病理组织学变化轻微。我们采用流式细胞技术观察1×10-5～6×10-5mol·L-1Tet对大鼠肝细胞生长的影响,结果表明Tet呈浓度依赖性促进G1期向S期转化,S期DNA含量及G1、G2期细胞蛋白质含量显著增加;不同浓度的Ca2+及ATP可促进或抑制肝细胞生长,加入外源性Ca2+及ATP对Tet促肝细胞增值无显著影响,提示Tet促进肝细胞增殖作用与阻断Ca2+内流无关。2.2肝组织病理学检测Tet能够显著减轻CCl4诱导大鼠实验性肝纤维化程度,降低纤维化大鼠血清ALT、透明质酸(hyaluronicacid,HA)、Ⅲ型前胶原(procollagenⅢpeptide,PⅢP)含量,改善肝功能,减轻肝病理损害程度,抑制肝细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)形成,胶原沉积减少。Tet治疗组大鼠肝组织中星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)的增殖、转化下调,结蛋白阳性细胞数减少,图像分析表明单位面积肝组织胶原沉积比例明显低于模型组,效果与阳性对照药物秋水仙碱相似。HSC为寄居于肝窦Diss间隙的间质细胞。生理条件下,HSC处于相对静止状态,其主要功能是维持ECM动态平衡和贮存维生素A。病理状态下,多种因素(尤其是各种细胞因子)诱导HSC激活、增殖、转化为肌成纤维样细胞,合成和分泌大量胶原,ECM的成分和数量发生改变。此病理过程是肝纤维化发生发展的关键。体外研究表明Tet可显著抑制常规培养HSC的激活,减少DNA及胶原合成,下调Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达;阻断PDGF促HSC增殖及胶原合成作用;减少HSC激活过程中PDGF、PDGF受体β(PDGF-Rβ)及转化生长因子β1(transforminggrowthfactor,TGFβ1)的自分泌;下调PDGF、PDGF-Rβ、TGFβ1及平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)的mRNA表达水平,提示Tet可能通过阻滞细胞外Ca2+内流、抑制脂质过氧化、干预细胞因子表达及减轻炎症反应等途径阻断肝纤维化的发生发展。临床研究显示肝硬化患者口服Tet3mon后,静脉色氨酸耐量实验明显改善;服药6～18mon后,血清PⅢP、HA含量显著下降;肝、肾功能不同程度得以改善;肝组织穿刺活检发现治疗前后患者肝组织炎性细胞浸润明显减轻或消失,胶原纤维沉积减少,Ⅰ型及Ⅲ型胶原含量显著下降,疗效明显优于肝泰乐治疗组,提示具有一定的临床应用前景。2.3tet的应用门静脉高压是各种原因所致肝硬化的主要临床表现,由此导致上消化道出血等并发症而常为肝硬化患者的主要死亡原因。给予实验性肝硬化大鼠分别静脉注射Tet2.0、6.0、20mg·kg-1·d-1,发现Tet可剂量依赖性降低门静脉压力和门静脉血流量、平均动脉压及外周阻力。Huang等给予门静脉部分结扎致门静脉高压模型大鼠20mg·d-1灌胃,每日2次,连续8d,能够显著减低门静脉压力,同时能够降低正常大鼠的平均动脉压和外周阻力,但对腹腔脏器及肾脏血流动力学无明显影响。我们临床研究表明Tet能够显著减低肝硬化患者门静脉压力,减少门静脉血流量,降低食管曲张静脉压力;连续用药患者2年内无再次出血率达87.6%,疗效显著显著优于安慰剂、硝苯地平及维拉帕米。对628例肝硬化并发食管曲张静脉破裂出血患者随访1～9年,发现口服Tet加硬化剂注射组较单纯硬化剂注射组的曲张静脉闭塞率高,再出血发生率及死亡率降低。Tet减低门静脉压力可能与阻滞血管平滑肌细胞电压依赖性及受体依赖性Ca2+内流和细胞内Ca2+动员,扩张外周血管,减少回心血量有关。Tet在降低肝硬化大鼠门静脉压力的同时,还可明显增加胃粘膜前列腺素E2的含量,改善胃粘膜的屏障功能,对门脉高压性胃病具有防治作用。3tet的应用肺纤维化及肺动脉高压是多种慢性肺部炎症病变的最终转归。1×10-7～1×10-4mol·L-1Tet可剂量和时间依赖性抑制内毒素及干扰素-γ诱导肺泡巨噬细胞环氧化酶-2(cyclo-ocygenase,COX-2)和诱生型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)产生和促炎因子释放。显著抑制人血清或血清加PDGF、表皮生长因子及TNF诱导体外培养肺成纤维母细胞增殖,下调3H标记胸腺嘧啶3H-TdRDNA参入,减少胶原合成。Tet可降低石英尘吸入大鼠的全肺干重,Ⅰ型及Ⅲ型胶原含量显著低于模型组,还使其mRNA水平下调,提示Tet可在转录水平抑制胶原合成;Tet单独或与羟基磷酸哌喹联合应用治疗矽肺,患者呼吸系统症状缓解率为55.7%～66.0%,X线胸片好转率为3.3%～13.3%,疗效明显高于肺灌洗及安慰剂组。Tet50、100、150mg·kg-1·d-1灌胃3wk,可剂量依赖性降低实验性炎性肺动脉高压大鼠肺动脉压力及右心指数,对全身动脉压无明显影响;用Verhoff胶原染色和计算机图象分析系统进行组织学检查发现100mg·kg-1·d-1Tet可显著降低纤维间隔厚度和面积,可使肺动脉高压大鼠肺腺泡内动脉中膜厚度、中膜厚度占血管外径百分比、肌型动脉数及部分肌型动脉数分别减少16.4%、30.5%、24.3%和16.4%,并使无肌型动脉数增加24.7%,肺腺泡动脉内