双壳经济贝毒安全性评价及分析

双壳经济贝毒安全性评价及分析

麻痹性核毒（psp）是一种非常易溶于水的药物。一些溶解于甲醇和酒精，而不是大多数非极性溶剂，如乙醛和石油醚。它是一种生物碱,容易从酸性溶液中萃取。来源于贝类摄食海洋中有毒藻类而在体内蓄积,主要包括双鞭甲藻属Alexandriumspp1,Pyrodiniumspp1,Gymnodiniumspp1,及四种蓝绿藻Aphanizomenonflos–aquae,Anabaenacircinalis,Lyngbyawollei和Cylindrospermopsisraciborskii。该毒素是一类神经肌肉麻痹剂,症状包括四肢肌肉麻痹、头痛恶心、发烧、皮疹等,严重的会导致呼吸停止,已经成为国际条约中的化学武器。目前还没有针对PSP的特效解毒剂,因此人类摄入超过一定限量时,致死率达100%。近年来,赤潮、跨洲轮船和近海工业的污染等方面原因导致毒源增加,使得国内染毒贝类的面积也增加,贝类的食用安全存在隐患。天津市作为国内重要的沿海城市,是重要的水产品批发集散地,但不曾开展过专项贝类安全的监督调查工作,目前在可查阅的有关市售贝毒的调查研究资料更是空白。本文对天津市内尖山路水产品批发市场上销售的双壳贝类PSP进行抽样调查,每月采样一次,周期为一年,为本地及北方水产品贝类食品的安全性评价提供依据,同时为卫生监督部门提供基础数据。1材料和方法1.1经济贝类标及样品数量2011年2月-2012年1月,以月为周期,在天津市尖山路水产品批发市场采购贝类样品,时间为期一年,总共采集10种,103个日常食用贝类样品,销售量大的主要经济贝类标为每月必采项,再根据当月市售品种变化稍有增加,具体样品名称及产地、数量见表1。每个样品量为3kg,以保证满足两种毒素检测试验的出肉率,采集完成后迅速送至样品前处理室,以清水冲洗贝类样品外壳,待去除表面泥沙等附着物后,再用解剖刀将其软组织与壳分离,搅碎后将待检样品装于高密度食品级塑料袋中,抽真空密封,立即放入-20℃冰箱冻存备用。另外,前处理样品时虾夷扇贝、栉江珧样品的消化腺与贝肉分离,单独保存。1.2检测方法1.2.1小鼠贝样毒性试验按照GB/T5009.213-2008贝类中麻痹性贝类毒素的测定方法对所有贝类样品进行提取和检测。取解冻后样品100g于1000mL烧杯中,加入0.18mol/L盐酸溶液100mL,搅拌均匀,调节pH为2.0~4.0之间,逐滴匀速加入5mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液调整烧杯中混合物pH保持在3.0左右,充分搅拌温和煮沸5min,冷却至室温后,将混合物移至250mL量筒中加入0.18mol/L盐酸溶液稀释至200mL,倒回烧杯,再次调节pH至3.0左右,沉降半小时后,取上清液50mL于4000r/min离心5min,取上清液lmL对小鼠进行腹腔注射。试验小白鼠3只为一组,每个样品注射一组试验用鼠,称量小鼠体重精确至0.5g,精确记录小白鼠注射时刻及死亡时刻。根据小鼠体重和死亡时间查对国标附表,计算毒素含量,毒素含量以鼠单位(Mouseunit,Mu)表示,1个鼠单位(MU)定义为15min杀死1只20g重小白鼠的腹腔注射剂量。取贝肉和消化腺毒素含量的加权平均值作为贝样毒性测定结果。本实验所用小白鼠全部购自于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心,为ICR雄性SPF级,体重均在19~21g之间,许可证号SCXK-(军)2007-004。1.2.2高效液相色谱法hplc2结果2.1麻醉性贝毒的检出情况2011年2月-2012年1月所监测的10种,103个贝类样品中,虾夷扇贝全年均检测出PSP阳性,毛蚶在5、6、7月期间结果呈阳性,波纹巴非蛤在6月中有染毒现象,数据结果见表2。所检测的10种经济贝类中虾夷扇贝、毛蚶、波纹巴非蛤3种检出麻痹性贝类毒素,占采样种数的30%,总共16个样品呈阳性,检出率为16%,阳性样品中超标率为19%(见图1)。在染毒种类中,虾夷扇贝12个月均有检出,检出率为100%;毛蚶样品中有3例检出,分别出现在2011年5、6、7月,占该种总数的25%;波纹巴非蛤中只有2011年6月独次检出,检出率为8%。全部检样毒力范围分布在49~530Mu/100g之间,根据FAO及我国渔政渔港监督管理局制定的贝类PSP安全食用警戒线400Mu/100g的标准,通过消化腺与贝肉加权平均计算结果,阳性样品中共有3个虾夷扇贝样品超标,不得食用,占该贝种超标率25%,占所监测全部样品的总超标率3%。2.2stx毒素的毒性对检测出的阳性样品中2011.5毛蚶和2011.6虾夷扇贝的消化腺进行HPLC检测,根据各毒素的毒性值换算为相对于STX毒素的毒性水平(μgSTXeq·100g-1)。结果见表3。结果显示,2个阳性样品中共检测出6种麻痹性贝毒成分,其中低毒力的C1、C2检出率最高,且为毒素中主要成分,分别占总毒性的70.1%和59.2%;而高毒力的STX、GTX1检出率低,且检测出少量或未检出;中毒力的GTX2、GTX3均有检出分别占总毒力的24.7%和36%。3虾夷小贝毒的年、月际变化特性产地为大连獐子岛的虾夷扇贝是天津市售贝类中PSP染毒率最高的贝种,其次为唐山拐子庄所产毛蚶,来自山东荣成的波纹巴非蛤亦有一例阳性,2011年6-8月虾夷扇贝PSP毒力超标,明显高于其他月份和种类,期间正值北方夏季,大部分贝类处于生长繁殖期,贝肉肥硕,油脂丰富,消化腺、生殖腺相对膨胀。本项目2011年4、5月份的虾夷扇贝样品为全样检测,其余月份则是将消化腺与贝肉分开单独检测,毒力值以加权平均表示,消化腺毒力最高值出现在2011年6月份,达到2332Mu/100g,贝肉均未检出PSP毒素。在2011年5-7月份,毛蚶和波纹巴非蛤共4例被检测出阳性样品,毒力范围在183~226Mu/100g,均未超标,但不容轻视,在此期间应避免食用含毒贝类,以防发生任何中毒反应。种间PSP含量虾夷扇贝>毛蚶>波纹巴非蛤>其他。通过本次监测,观察出麻痹性贝类毒素在天津市售贝类中存在着明显的时空、种间差异。虾夷扇贝染毒率最高,且毒性最强,毒性大小随季节的变化而变化,呈现出一定的规律性,夏季染毒种类、毒力值均最多且较高,而秋冬季较低,趋势见图2,含毒量夏季>春季>秋季>冬季。绝大部分贝类是“非选择性”的滤食性生物,在贝类的生长过程中,极易摄食海水中的有毒藻类,使有毒生物的毒素在自身体内累积和转化,由于南北海域中存在的藻种不同也导致贝体中毒素种类及含量各不相同。本文中HPLC所检测的两种阳性样品仅代表其产地,即唐山拐子庄及大连獐子岛地区。至今为止麻痹性贝类毒素已发现30种,常用于分析的亦有C1、C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、neoSTX、STX、dcSTX等12种,本文仅具备7种标准品供检测,故结果与生物法测定有一定差值,有待进一步研究。总体来说,麻痹性贝毒在天津市场范围内检出率及含量整体水平较低,通过对检测对象差异(贝肉、消化腺)所得到的结果说明虾夷扇贝消化腺染毒率高且毒性大,由于毒素在高温条件下亦不能降解或去除,故食用时应将消化腺剔除,操作时切勿破坏腺体,防止毒素污染可食部分。本研究是针对天津市场所销售双壳贝类为研究对象,结果可以直接作为评估市售贝类的污染状况和食用安全性的依据,夏季是天津市场染毒高峰期,希望能够提示有关部门可在春季预防,在夏季加强对食用贝类的监测和宣传,保证市民健康安全。以Oshima建立的PSP高效液相色谱(HPLC)分析方法为基础,对小白鼠生物法检测为阳性的样品,上清液经0.22μm滤膜过滤,所得滤液作为HPLC分析。采用Agilent1100系统对毒素进行分析,色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18反相柱(150mm×4.6mm),柱温35℃,荧光检测器为AgilentG1321A,检测激发波长330nm,发射波长390nm。应用江天久教授麻痹性贝毒的HPLC分析方法,采用3次等梯度洗脱:第1次分析GTX类毒素,洗脱液为含有3.0mmol/L庚烷磺酸钠的10mmol/L磷酸铵缓冲液,pH7.1;第2次分析STX类毒素,洗脱液为含有2.0mmol/L庚烷磺酸钠的30mmol/L磷酸铵缓冲液,pH7.1,并按100∶5(V∶V)的比例加入乙腈;第3次专门分析C类毒素,洗脱液为1.2mmol/L的四丁基磷酸铵