川大黄粉水解大黄酸的研究

川大黄粉水解大黄酸的研究

中药大黄的化学成分非常复杂。具有抗菌和抗癌活性的成分是th衍生物，主要包括大黄酸、大黄素、芦苇大黄素、大黄酚和大石基。有关大黄蒽醌衍生物的提取分离,目前使用最多的方法是硫酸水解、三氯甲烷提取及pH梯度分离的系统分离法。在实际工作中笔者发现该法提取大黄素很有效,但大黄酸提取率很低,且纯度不高(常混入30%～50%的大黄素),不适合大黄酸的提取。主要原因可能为:(1)从大黄酸分子结构来看,由于它在7(3)位是羧基(-COOH),极性比大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚都强,决定了其在有机溶剂中溶解度最小,用三氯甲烷提取时大黄酸溶出少,其它几个组分的溶出多,要使大黄酸有较高的收率,提取液的体积就会很大;(2)2.5%KHCO3溶液的pH值偏高,提取大黄酸时,大黄素也被提出来了。如果这两个问题能很好的解决,不仅可以大大提高大黄酸的收率和纯度,依次还可使大黄素的纯度提高,因为大黄酸被提走就没有东西进入大黄素组分了。近年文献报道大黄酸、大黄素不但有很强的抗菌、抗炎、抗癌作用,还具解毒、抗衰老、诱杀柯萨奇病毒B3、免疫双向调节、降脂减肥、抗动脉硬化等功能,被认为是具有多靶点多功能的药物。在目前众多的有关文献报道中,还没有专门讨论大黄酸提取方法的,研究大黄酸的提取工艺对开发天然药物有重要实际意义。1大黄酸的提取大黄样品供试大黄为重庆中药材市场购买的川大黄。样品大黄经捡选去杂,于70℃烘干,然后用中药专用粉碎机粉成40目的粉,密闭保存备用。仪器和试剂本研究涉及仪器主要为液相色谱仪。大黄酸标品自制,HPLC分析含量大于98%,其余试剂均为分析纯。提取大黄酸的溶剂选择试验用三氯甲烷、乙醇、异丙醇、丙三醇、三氯甲烷+丙三醇分别提取水解后的大黄粉末,用液相色谱仪测定大黄酸的峰面积,峰面积大说明提取效果好。流动相:甲醇∶0.1%磷酸水溶液为70∶30,依利特C18柱(4×260mm),检测波长220nm。样品色谱图如下:水解温度和时间对大黄酸提取的影响称大黄粉5g,加50ml20%硫酸分别于29℃(室温)50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水解4h,过滤、洗渣到中性后于70°烘干,再用100ml三氯甲烷分4次振荡提取,最后定容到100ml。取此液2ml定容到25ml,用液相色谱仪测大黄酸的峰面积。同法在70℃分别做1、2、2.5、3、3.5、4、5h的水解试验。大黄酸的分离用2.5%、0.5%、0.2%、0.1%KHCO3溶液萃取大黄酸,盐酸沉淀,水洗、烘干、称重得粗大黄酸。取一定量的粗大黄酸甲醇溶解,用液谱仪测定大黄酸峰面积,观察色谱峰的个数,计算相对峰面积百分率来代表其纯度。2提取溶剂和萃取条件的筛选水解温度和时间对大黄酸的影响大黄中的大黄酸以游离和结合态存在,结合态(主要为单糖和二糖甙)不能用溶剂直接提取,需水解成游离态才能提取出来。从图2可见:水解后大黄酸的量明显增加;随着水解温度的增加,大黄酸也增加,当温度为70℃时达到最高,温度再增加大黄酸保持不变,说明在70℃水解过程已经完成。用20%硫酸在70℃水解大黄粉时,水解时间在3h大黄酸的量达高峰值(见图3)。综上所述,大黄中的大黄酸用20%的硫酸在70℃时3h可完成水解。水解完成后大黄酸比没水解(29℃)增加了91.55%(以峰面积计算).说明试验用川大黄中有近一半的大黄酸是结合态,需水解才能提出来。提取溶剂的影响大黄酸7(3)位为羧基,分子极性大,在氯仿中的溶解度很小,在甲醇等醇类中溶解度相对较大。用目前常用的溶剂三氯甲烷、乙醇、异丙醇和丙三醇在同等条件下作溶出试验,结果大黄酸的峰面积比分别为1、2.2、1.3、4.3;可以看出同等条件下丙三醇和乙醇溶出的大黄酸比三氯甲烷和苯高一倍和三倍,见图4和图5。丙三醇在增加大黄酸溶出的同时,也引入了更多的非蒽醌杂质(图5峰I)分离纯化时不易除去;况且强亲水的丙三醇和梯度洗脱的缓冲液互溶,不能用PH梯度洗脱法把大黄酸分离出来。经筛选试验发现丙三醇加入三氯甲烷中可以增加大黄酸的溶出,而不增加杂质的溶出。从图6可以看出,加入丙三醇后杂质溶出量大大减少,但大黄酸的量却有增加。丙三醇是中药提取常用的助溶剂和溶剂,符合安全卫生要求,在后面的pH梯度分离提取大黄酸时,不会引起溶液pH的变化,又很容易和大黄酸分离。由此可见,丙三醇加入三氯甲烷中不仅能提高大黄酸的溶出量减少杂质溶出,满足pH梯度分离对溶剂的要求,还符合安全卫生标准,是最佳的选择。进一步的研究表明丙三醇的加入超过一定量会减少大黄酸的溶出,过大还出现提取液分层的现象。从图7来看:(1)丙三醇的量增加,大黄酸量也增加,当丙三醇在三氯甲烷中达10%时大黄酸的溶出量最大,和纯三氯甲烷比最高增加315%(峰面积计算);(2)丙三醇超过10%,大黄酸略有下降。由此可以认为用含丙三醇8～10%的三氯甲烷多次提取效果最好。KHCO3提取大黄酸效果比较提取液先用水洗2～3次,使大部分丙三醇被水洗走;大黄酸不溶于水留在三氯甲烷相里。pH梯度洗脱的第一步是用2.5%KHCO3溶液提取大黄酸,实验发现大黄素很易和大黄酸一起出来,使得大黄酸组分里含有约30%～50%的大黄素。随着KHCO3浓度的降低,提取的大黄酸中大黄素的含量逐渐减少(见表1)。萃取条件:室温,间歇振荡,时间30min,与提取液等体积的萃取剂分三次萃取。粗品大黄酸甲醇溶解用HPLC测定峰面积,计算大黄酸、大黄素和杂质峰面积百分比代表各自百分含量。3大黄粉溶剂的制备试验用川大黄中的大黄酸约50%为结合态,用20%硫酸70℃水解3h可完成水解释放出该部分大黄酸