第十三章  平面色谱法

分析化学——药用化学基础第十三章  平面色谱法

薄层色谱法平面色谱法概述01020304目录

纸色谱法实训十五酚酞片中荧光母素的检查目前，色谱法在医学检验、卫生监测、食品及药品检验等领域的重要分析手段，具有灵敏度高、选择性高、分离效能高、分析速度快及应用范围广等优点。在《中国药典》（2020版）里，中药材及其制剂的鉴别中，多数都应用了薄层色谱法，比如人参、牛黄、丁香等。学习导学§13-1

平面色谱法概述学习目标1.掌握色谱法的基本原理2.熟悉色谱法的分类3.了解色谱法的特点一、原理1.原理

主要是利用样品中的各组分在流动相与固定相之间的分配系数差异而实现分离。通过两相的相对运动，使物质在两相中进行多次反复分配，分配系数大的物质（组分）迁移速度慢，反之则迁移速度快，从而被分离。组分固定相流动相图13-1吸附柱色谱法的色谱过程示意图一、原理2.

分配系数K是指在一定温度和压力下，某组分在两相间的分配达到平衡时的浓度（或溶解度之比），即：二、分类

流动相是气体。当固定相是固体时，称为气-固色谱；固定相是液体时，称为气-液色谱。液相色谱法液相色谱法按两相物理状态分类

流动相是液体。当固定相是固体时，称为液-固色谱；固定相是液体时，称为液-液色谱。二、分类

按分离原理分类离子交换色谱法吸附色谱法利用不同组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离目的的方法。

利用不同组分在固定相和流动相中的溶解度的差别而实现分离目的的方法。分配色谱法

利用不同组分因分子大小不同受到固定相的阻滞差别而实现分离目的的方法。分子排阻色谱法(也称为空间排阻色谱法)利用不同组分离子交换能力的差别而实现分离目的的方法。二、分类纸色谱法(PC)柱色谱法(CC)将固定相装在色谱柱内，流动相携带样品自上而下移动使不同组分分离的方法。

将固定相均匀地涂布于玻璃板上形成厚薄均匀的薄层，点样后用流动相展开使不同组分分离的方法。薄层色谱法(TLC)以色谱滤纸为载体，滤纸纤维上吸附的水为固定相，点样后用流动相展开使不同组分分离的方法。按操作形式分类(1)灵敏度高(2)选择性高(3)分离效能高(4)分析速度快(5)应用范围广三、特点§13-2薄层色谱法学习目标1.掌握薄层色谱法的原理、操作方法和定性、定量的应用。2.了解薄层色谱法的吸附剂和展开剂，以及薄层色谱法的应用。1.概念：将固定相（如吸附剂）均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上，形成0.25～1mm厚的薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法称为薄层色谱法。一、原理2.比移值Rf：一、原理图13-2Rf值的测量示意图2.比移值Rf：根据Rf值的定义，其值在0～1之间变化。分配系数越小，Rf值越大。组分之间的分配系数相差越大，则各组分的Rf值相差也越大，表示越易分离。一、原理3.影响比移值Rf的因素：展开剂的组成展开时的温度展开剂蒸气的饱和程度薄层的性能一、原理二、仪器与材料１.薄层板按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等。按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。按固定相粒径大小分为普通薄层板（10～40μm）和高效薄层板（5～10μm）。二、仪器与材料2.点样器

一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。二、仪器与材料3.展开容器

上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。水平展开用专用的水平展开槽。二、仪器与材料4.显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。二、仪器与材料5.检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。暗箱内光源应有足够的光照度。二、仪器与材料6.薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。三、操作方法1.薄层板的制备干法铺板操作简单，只适用于氧化铝和硅胶。铺成的软板不坚固、易松散，展开时只能近水平展开，显色时易吹散，操作时应非常小心、细致。软板一般用于摸索色谱展开的条件。三、操作方法1.薄层板的制备湿法铺板倾注法制板平铺法制板机械涂铺法制板三、操作方法2.点样在薄层板的一端1.5〜2cm处点样；内径为0.5mm的平头毛细管或微量注射器点样；点样斑点直径不宜超过2〜3mm，斑点之间的间距为2cm；若样品溶液浓度太稀，可反复点几次；为了避免在空气中吸湿而降低活性，一般点样时间不超过10min为宜；点样后待溶剂挥发，即可放入色谱缸内展开。三、操作方法3.展开展开剂不与被测组分发生化学反应；Rf值要求在0.3~0.8之间，Rf值之间应相差0.05以上；易于获得边缘整齐的圆形斑点；尽可能不用高沸点溶剂做展开剂，便于干燥。三、操作方法4.显色紫外灯显色显色剂喷洒压板法侧吮法四、操作条件1.吸附剂的选择吸附指溶质在液-固两相的交界面上集中浓缩的现象。吸附剂一般为多孔性微粒状物质，其表面有许多吸附中心，当组分分子占据吸附中心时，即被吸附，当流动相(洗脱剂)分子从吸附中心置换出被吸附的组分分子时,即为解吸。四、操作条件1.吸附剂的选择类型

氧化铝氧化铝G、氧化铝H、氧化铝HF254硅胶硅胶H、硅胶G、硅胶HF254四、操作条件2.展开剂的选择分离中各斑点的Rf值要求在0.3~0.8之间，Rf值之间应相差0.05以上；如果做碱性物质分离时，在展开剂中可适当加入碱性溶剂，如氨水或吡啶等；如分离酸性物质时，可在展开剂中适当加入酸性溶剂如乙酸、甲酸等。五、定性和定量1.定性薄层色谱定性分析的依据是：在固定的色谱条件下，相同物质的Rf值相同。五、定性和定量1.定性定性方法：已知物对照法相对比移值法五、定性和定量2.定量目视定量法洗脱定量法薄层扫描仪定量六、应用和实例优点设备简单操作方便展开迅速显色容易能用腐蚀性显色剂常用于有机物的分离和鉴定药物分析卫生监测环境保护氨基酸及其衍生物的分析§13-3纸色谱法学习目标1.掌握纸色谱法的原理。2.了解纸色谱的操作方法和应用。1.概念：纸色谱法是以滤纸作为载体的色谱法，按分离原理属于分配色谱法的范畴。固定相一般为滤纸纤维上吸附的水，流动相为不与水混溶的有机溶剂。一、原理二、仪器与材料１.展开容器通常为圆形或长方形玻璃缸；缸上具有磨口玻璃盖；应能密闭。二、仪器与材料2.点样器

常用点样器：具有支架的微量注射器（平口）或定量毛细管（无毛刺）；点样位置正确、集中。二、仪器与材料3.色谱滤纸

质地均匀平整，具有一定机械强度，不含影响展开效果的杂质；不应与所用显色剂起作用，以免影响分离和鉴别效果，必要时可进行处理后再用。三、操作方法1.点样在距纸的一端2~3cm处点样；用内径为0.5mm均匀的玻璃毛细管或微量注射器吸取样品溶液；将1~2μl的样品溶液均匀地点在已做好标记的起始线上,点样斑点直径不宜大于2~3mm，样点之间的间距为2cm；若样品浓度较稀，可反复点几次，每点一次须用电吹风吹干后再点第二次；点样量不宜过多，否则易造成拖尾。三、操作方法2.展开化合物类别展开溶剂显色剂有机酸正丁醇:醋酸:水4：1：5正丁醇:乙醇:水4：1：5漠甲酚绿(溶解0.04g漠甲酚绿于100ml乙醇中，加O.Olmol/LNaOH直到刚出现蓝色为止)显黄色斑点酚类正丁醇:醋酸:水4：1：5正丁醇:毗嚏:水2：1：5三氯化铁(溶解2g三氯化铁于100ml0.5mol/LHC1中)显蓝色或绿色斑点糖类正丁醇:乙醇:水4：1：5正丁醇:醋酸:水4：1：5邻苯二甲酸苯胺(0.93g苯胺、1.66g邻苯二甲酸溶于100ml水饱和的正丁醇中)105℃加热，呈红色或棕色斑点氨基酸正丁醇:醋酸:乙醇:水4：1：1：2戊醇:毗嚏:水35：35：30水饱和的酚茚三酮(0.3g茚三酮溶于100ml醋酸)80℃加热，呈红色斑点常用的展开剂和显色剂三、操作方法2.展开上行展开法下行展开法双向展开法辐射水平展开法三、操作方法3.显色展开完毕后，取出滤纸，在展开剂到达的前沿用铅笔轻轻划一记号，在室内晾干，即可观察到色斑，然后在紫外灯下观察荧光斑点，标出位置、大小，并记录颜色及强度。如某些组分既不显色斑，又不显荧光，则可根据组分的特性反应，喷洒合适的显色剂，使色谱斑点显色。需要加热后才能显色的则可用烘箱或电吹风加热。四、色谱滤纸的选择与处理滤纸的要求质地均匀、纯净、平整无折痕，边缘整齐，以保证溶剂展开速度均匀；纸质的松紧和厚度适宜;应有一定的机械强度，不易断裂。四、色谱滤纸的选择与处理滤纸的选择当几种组分的Rf值相差很小时，宜采用慢速滤纸；若几种组分的Rf值相差较大时，则可采用中速滤纸或快速滤纸；需考虑展开剂的性质；定性鉴别选用薄滤纸，制备定量应选用厚滤纸。四、色谱滤纸的选择与处理滤纸的预处理为了适应某些特殊需要，可将滤纸进行预处理，使具有新性能。

例如：将滤纸浸入一定pH值的缓冲溶液中处理后，使滤纸维持恒定的酸碱度，用于分离酸、碱性物质。用甲酰胺、二甲基甲酰胺等代替水作固定相，以增加物质在固定相中的溶解度，用于分离一些极性较小的物质，降低Rf值，改善分离效果。五、定性和定量1.定性经过显色反应可粗略知道样品属于哪一类物质:如样品喷洒茚三酮后显色，知样品中含有氨基酸。喷洒三氯化铁显色，则样品含有酚类物质等。具体要知道每个色斑是哪一种物质，则需测量色斑的Rf值与已知物质的Rf值比较(或参阅文献资料),或测量色斑的Rf值后才可确定。五、定性和定量2.定量目测法剪洗法光密度测定法六、应用和实例优点仪器简单操作方便所需样品量少样品分离后各组分的定性、定量都比较方便广泛应用于混合物的分离、鉴定、微量杂质的检查对中草药成分的研究;卫生检验毒物测定;生化检验中氨基酸、蛋白质、酶等的分离鉴别等。实训十五酚酞片中荧光母素的检查一、实训目的1.薄层色谱法的操作二、器材准备１.器材薄层板、毛细管、展开缸、紫外灯２.试剂与试药荧光母素对照品、无水乙醇、环己烷、二甲苯、浓硫酸三、实训内容与步骤1.荧光母素取本品的细粉适量（约相当于酚酞0.1g），加无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中含20mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.另取荧光母素对照品适量，用无水乙醇制成每1ml中含0.10mg的溶液，作为对照品溶液。三、实训内容与步骤3.吸取供试品溶液与对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以无水乙醇-环己烷-二甲苯（1：1：4）为展开剂，展开，晾干，喷以硫酸-无水乙醇（1：1），在105℃加热5～10分钟，置紫外光灯（365nm）下检视。4.供试品溶液如显与对照品溶液对应的杂质斑点，其荧光强度与对照品溶液的主斑点比较，不得更强（0.5%）。三、实训内容与步骤5.完成酚