第十五章  高效液相色谱法

分析化学——药用化学基础第十五章  高效液相色谱法

高效液相色谱仪高效液相色谱法概述01020304目录

高效液相色谱法的定性、定量分析

高效液相色谱法的应用2008年，三聚氰胺超标事件是一起食品安全事故。事故起因是很多食用三鹿集团生产的奶粉的婴儿被发现患有肾结石，随后在其奶粉中发现化工原料三聚氰胺。在三鹿婴幼儿奶粉事件发生后，国家批准发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准，标准规定了高效液相色谱法、气相色谱—质谱联用法、液相色谱—质谱／质谱法三种方法为三聚氰胺的检测方法。学习导学什么是高效液相色谱法？它与气相色谱法有何区别？它在食品、药品、工业分析中有什么作用呢？学习导学§15-1高效液相色谱法概述学习目标1.掌握高效液相色谱法的特点。2.熟悉高效液相色谱法流动相的要求以及预处理的方法。3.了解高效液相色谱法的原理。高效液相色谱法(HPLC)又称为高压液相色谱法或高速液相色谱法，是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。高效液相色谱法在药品研发、生产、质量控制、监督等领域中有广泛的应用。一、高效液相色谱法的原理1.原理用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱。注入的供试品由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，对供试品进行分离测定。一、高效液相色谱法的原理2.固定相高效液相色谱法使用最多的是化学键合相色谱法。（1）键合相种类非极性键合相:C18、C8、C1、ODS弱极性键合固定相:醚基和二羟基键合相极性键合相:氨基、氰基键合相一、高效液相色谱法的原理（2）键合相特点化学稳定性好，使用过程中不流失；均一性和重现性好；柱效高，分离选择性好；适于梯度洗脱；载样量大。（3）注意事项流动相中水相的pH值2～8。一、高效液相色谱法的原理3.流动相（1）HPLC对流动相的基本要求不与固定相发生化学反应;对试样有适宜的溶解度;与检测器相适应;纯度要高，黏度要小;微孔滤膜过滤，脱气。一、高效液相色谱法的原理3.流动相（2）流动相的极性和强度反相色谱系统：甲醇—水、乙腈—水，

流动相极性越强，洗脱能力越强。正相色谱系统：二氯甲烷—正己烷，流动相极性越强，洗脱能力越低。一、高效液相色谱法的原理3.流动相（3）流动相的预处理用符合液相色谱纯度要求的试剂配制流动相；使用前经微孔滤膜（0.45μｍ或0.22μｍ）过滤；流动相使用前必须脱气；储存于玻璃、聚四氟乙烯等容器内。二、高效液相色谱法的特点及分类1.特点分离效能高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、自动化程度高。（1）应用范围广。（2）流动相选择性高。（3）室温条件下操作。二、高效液相色谱法的特点及分类2.分类（1）液固吸附色谱法（2）液液分配色谱法（3）离子交换色谱法（4）离子对色谱法（5）分子排阻色谱法§15-2高效液相色谱仪学习目标1.熟悉高效液相色谱仪的分析依据和工作流程。2.掌握高效液相色谱仪的组成、主要部件的名称与作用。高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

高效液相色谱仪主要包括高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统。一、高效液相色谱仪的组成一、高效液相色谱仪的组成１.高压输液系统（１）高压输液泵用于完成流动相的输送任务，可分为恒压泵和恒流泵，多用恒流泵中的柱塞往复泵。高压输液泵一、高效液相色谱仪的组成（２）梯度洗脱装置等强度洗脱：同一个分析周期内流动相组成保持恒定。梯度洗脱：一个分析周期内以程序控制改变流动相的组成。一、高效液相色谱仪的组成2.进样部分安装在色谱柱的进口处，将试样引入色谱柱。常用六通阀进样器和自动进样器。自动进样器一、高效液相色谱仪的组成3.分离系统包括色谱柱、连接管、恒温器等。色谱柱作用是分离，由柱管和固定相组成。色谱柱一、高效液相色谱仪的组成4.检测系统紫外—可见分光检测器（UVD）荧光检测器（FLD）电化学检测器（ECD）示差折光检测器（RID）UVD

→色谱柱→样品在柱中分离→各组分依次进入检测器→显示器输出色谱图。二、高效液相色谱仪的工作流程流动相（储存于储液瓶中）待测样品1.准备工作：流动相，色谱柱，样品溶液，检查仪器。2.开机、参数设定及平衡系统：接通电源，启动工作站软件，更换流动相，排气泡，参数设定，平衡系统。3.检测：进样，测定，记录色谱图。4.清洗系统，关机。三、高效液相色谱仪一般操作规程1.正相键合相色谱法的分离条件（1）固定相：极性键合相为固定相，如氰基、氨基等。（2）流动相：烷烃加适量极性调节剂。四、高效液相色谱条件的选择2.反相键合相色谱法的分离条件（1）固定相：非极性键合相，如ODS（2）流动相：甲醇—水、乙腈—水（3）pH值：2～8（4）流动相的离子强度：加入0.1％～1％的醋酸盐、磷

酸盐等。四、高效液相色谱条件的选择五、高效液相色谱法系统适用性试验包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。不得改变：填充剂种类、流动相组分、检测器类型。可改变：色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等。§15-3高效液相色谱法的定性、定量分析学习目标1.掌握高效液相色谱法的定性、定量分析方法。2.熟悉高效液相色谱法的定量分析方法要求。一、定性分析方法1.利用保留时间定性定性的依据：在相同的色谱条件下，待测成分的保留时间与对照品的保留时间应无显著性差异。注意：两个保留时间不同的色谱峰归属于不同化合物，两个保留时间一致的色谱峰不一定是同一化合物。一、定性分析方法2.利用光谱相似度定性3.利用质谱检测器提供的质谱信息定性人造色素质谱图二、定量分析方法1.方法要求（1）流动相应用高纯度试剂配制，水为高纯水。（2）流动相和样品经0.45μｍ滤膜滤过，脱气。（3）系统适用性试验。（4）杂质检查调节仪器的灵敏度，色谱记录时间足够。二、定量分析方法1.方法要求（5）含量测定，RSD≤1.5%。（6）紫外检测器的检测波长＞溶剂的截止波长。（7）实验结束，冲洗系统。二、定量分析方法2.定量分析方法（1）外标法二、定量分析方法2.定量分析方法（2）内标法二、定量分析方法2.定量分析方法（3）内加法将待测物i的纯品加至待测样品中，测定增加纯品后的溶液比原样品溶液中i组分的峰面积增量，来求算i组分含量的定量分析方法。§15-4高效液相色谱法的应用学习目标了解高效液相色谱法在药品检验中的应用。一、中药中有效成分的分离、鉴定示例小儿热速清口服液中黄芩苷的鉴别色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—水—磷酸（47：53：0.2）为流动相；检测波长为276nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。二、含量测定示例盐酸小檗碱片中主成分盐酸小檗碱的含量测定色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液[0.05mol/L磷酸二氢钾溶液和0.05mol/L庚烷磺酸钠溶液(1:1)，含0.2%三乙胺，并用磷酸调节pH值至3.0]—乙腈(60:40)为流动相；检测波长为263nm；进样体积为20μL。理论板数按小檗碱峰计算不低于3000，小檗碱峰与相邻杂质峰之间的分离度应符合要求。三、药物中杂质的检