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文档简介

67.120.10CCS

22

DB36 36/T

1881—2023黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范Technical

specification

for

isolation

and

identification

of

Elizabethkingia

miricola

inRana

nigromaculata 江西省市场监督管理局 发

布

18812023

DB36/T

1881—2023

1.1—2020II

18812023

文件用于斑侧蛙米伊丽白菌离鉴定，他蛙米尔丽莎菌分鉴定参考

20222022

3.1

Double

pithing3.2

Polymerase

PCR个周期，3.3

sequencing3.4

DB36/T

1881—2023

图1

18812023

7.1

7.2

24

将培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于营养琼脂中，恒温培养箱（28

24

选取优势菌落接种于新的营养琼脂，恒温培养箱（28

24

7.3

7.3.2.1

PCR

0.5

灭菌生理盐水中，4000

0.5

100

10

4000

离心30

7.3.2.2

PCR

buffer

0.5

10

(2.5

0.2

ddH

12.8

20

7.3.2.3

PCR

16S

95

94

30

55

30

72

90

3272

10

基因扩增条件：95

预变性

94

变性30

55

退火30

72

延伸30

，共32个循72

10

7.3.2.4

扩增产物和

上样缓冲液，混匀后加入1.2%琼脂糖凝胶电泳加样孔中，同时在空白孔加入

标准品。电泳结束后，取出凝胶板置于紫外投射仪上，打开紫外灯观察或用凝胶成DB36/T

1881—20237.3.2.5

98%

24

10

7.20.2

15产生典型白内障病症状的感染蛙再次进行细菌分离，经16S

rDNA基因分子鉴定，所分离的细菌与米尔伊丽莎白菌（

）同源性达到98%以上，则证实分离的病原菌确定为黑斑侧褶蛙白内障

为了保护实验室人员的安全，应由具备专业知识的人员进行检测，所有培养物和废弃物参照

18812023

A.1

无菌工作台、手持式均质器（适用于

1.5

离心管）、恒温培养箱、恒温水浴锅、高速冷冻离心

0.01

A.2

90

2.5

µL10

µL100

0.2

）、1.5

2.0

DB36/T

1881—2023

B.1

10.0

5.0

10.0

7.2

0.225

0.2121

15

B.2

10.0

5.0

10.0

15.0

7.2

0.225

制作方法：将上述成分混合，加入双蒸水或去离子水，调整值至

0.2121

灭菌15

50

B.3

称取1.2

琼脂糖，加入100

缓冲溶液中，加入核酸染料，微波炉加热至完全融化，依据0.5

B.4

50TAE

242

100

0.5

pH8.01000

B.5

TAE

49B.6

16S

10

16S

27F

5

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