无菌检验培养基最小检出量方法验证实验

无菌检验培养基最小检出量方法验证实验·兽药典规定无菌检验用培养基灵敏性验证时接种相应质控菌菌落数为1-50CFU，这个范围较广，不能精确的验证培养基的灵敏性，故为了更精确的对培养基进行验证，确定其最小检出量，特进行此方法验证。名称质控菌流乙醇酸盐培养基（TG）金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌酪胨琼脂（GA）金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌葡萄糖蛋白胨（GP）白色念珠球菌、黑曲霉菌材料：名称厂家批号名称来源批号活菌数规格流乙醇酸盐培养基（TG）中海生物150420金黄色葡萄球菌自制2013019.5*105CFU/ml0.5ml/支酪胨琼脂（GA）中海生物151123铜绿假单胞菌自制2013018*106CFU/ml0.5ml/支葡萄糖蛋白胨（GP）中海生物151026白色念珠球菌自制2013011.6*104CFU/ml0.5ml/支蛋白胨OXOID869398生孢梭菌自制2013018*104CFU/ml0.5ml/支营养琼脂中海生物160229//////主要试剂配方3.1硫乙醇酸盐（TG）培养基：取培养基30g，加入1LMILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。3.2酪胨琼脂（GA）培养基：取培养基42g，加入1LMILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。3.3葡萄糖蛋白胨（GP)培养基：取培养基28g，加入1LMILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。3.4半固体TG培养基：分别取TG培养基30g、GA培养基1g，加入1LMILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。3.50.1%蛋白胨水：取1g胰蛋白胨，加入100mlMILLIPORE水，溶解后121℃灭菌15min，放置室温后，置2-8℃保存。实验方法4.1GA/TG培养基最小检出量实验将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌用0.1%蛋白胨水还原后，分别按照表3进行稀释，取理论菌落数为1CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml、15CFU/0.2ml、20CFU/0.2ml的稀释度,金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌每个稀释度分别接种TG、6支，每支0.2ml,3支置25℃培养箱，另3支置37℃培养箱分别培养7日，每天观察小管污染情况并记录；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌接种GA斜面6支，每支0.2ml,3支置25℃培养箱，另3支置37℃培养箱分别培养7日，每天观察小管污染情况并记录。同时金黄色葡萄球菌每个稀释度接种2副营养琼脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培养。铜绿假单胞菌每个稀释度接种2副酪胨琼脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培养。生孢梭菌每个稀释度接种2管半固体TG培养基，每管0.2ml菌液,置37℃培养。TG/GA小管配制日期：2016.03.21接种日期：2016.03.23表3铜绿假单胞菌、生孢梭菌、金黄色葡萄球菌最小检出量验证稀释方法铜绿假单胞菌管号原瓶①②③④⑤⑥⑦⑧⑨1011稀释液ml1ml4.599997.46756加样量/取原瓶0.5取①1取②1取③1取④1取⑤4取④2取⑤取④1取⑤2.5取⑥1CFU/ml4*1064*1054*1044*103400（计数）75（计数）35（计数）1007550255CFU/0.2ml///////20151051生孢梭菌管号原瓶①②③④⑤⑥⑦⑧⑨//稀释液ml1ml4.599934.372.44//加样量/取原瓶0.5取①1取②1取③1取②1取②1取②1取③4取⑧1//CFU/ml4*1044*1034004041007550255//CFU/0.2ml/////20161051//金黄色葡萄球菌管号原瓶①②③④⑤⑥⑦⑧⑨//稀释液ml1ml4.54.54.53.755.24.254.2524.5//加样量/取原瓶0.5取①0.5取②0.5取③1取③1取③0.5取③0.5取⑦2取⑦0.5//CFU/ml4.75*1054.75*1044.75*1034.75*102100755050255//CFU/0.2ml////2015101051//4.2GP培养基最小检出量实验将白色念珠球菌用0.1%蛋白胨水还原后，分别按照表4进行稀释，取理论菌落数为1CFU/0.2ml、2CFU/0.2ml、4CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml的稀释度，每个稀释度分别接种GP斜面3支，每支0.2ml置25℃培养箱，每天观察小管污染情况并记录。同时每个稀释度接种2副酪胨琼脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。GP小管配制时间：2016.04.08检验日期：2016.04.09—2016.04.16表4白色念珠菌最小检出量验证稀释方法白色念珠菌管号原瓶①②③④⑤⑥⑦⑧稀释液ml1ml4.594.54.4371.81.8加样量/取原瓶0.5取①1取②0.5取②2取②1取②1取③3取②3CFU/ml8000800808252010550CFU/0.2ml////542110接种管号////√√√√√实验结果5.1硫乙醇酸盐培养基最小检出量的实验结果按照4.1的实验方法，确定金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌在流乙醇酸盐培养基中的最小检出量，结果见表5、表6、表7。表5金黄色葡萄球菌在流乙醇酸盐培养基中的最小检出量时间最终接种菌数（CFU）1510152037℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃第1天（+）3/30/33/30/33/30/33/30/33/30/3第2天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第3天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第4天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第5天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第6天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第7天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3培养结果1/33/33/33/33/3计数菌数（CFU)1,03,412.1816.1620,22表6铜绿假单胞菌和生孢梭菌在流乙醇酸盐培养基中的最小检出量时间生孢梭菌最终接种菌数（CFU）铜绿假单胞菌最终接种菌数（CFU25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃第1天（+）3/30/33/30/33/30/33/30/33/30/31/30/32/30/33/31/33/30/33/30/3第2天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第3天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第4天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第5天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第6天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第7天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3培养结果3/33/33/33/33/31/32/33/33/33/3计数菌数（CFU)2,29，1026,2429370,00,06,42,24,8结果表明：硫乙醇酸盐对金黄色葡萄球菌的最小检出量为3CFU、对生孢梭菌最小检出量为2CFU、对铜绿假单胞菌的最小检出量为2CFU。备注：理论接种菌落数与同步计数菌落数有一定差异，结论以实际计数结果为准。铜绿假单胞菌实际结果与计数结果差异较大，2次重复试验均如此。5.2酪胨琼脂培养基最小检出量的实验结果按照4.1的实验方法，确定金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌在酪胨琼脂培养基中的最小检出量，结果见表7。表7金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在酪胨琼脂培养基中的最小检出量时间金黄色葡萄球菌最终接种菌数（CFU）铜绿假单胞菌最终接种菌数（CFU25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃第1天（+）0/30/33/30/33/30/33/30/33/30/30/30/33/30/33/30/33/30/33/30/3第2天（+）2/31/33/32/33/33/33/33/33/33/31/30/33/32/33/33/33/33/33/33/3第3天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/30/33/32/33/33/33/33/33/33/3第4天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/30/33/32/33/33/33/33/33/33/3第5天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/33/32/33/33/33/33/33/33/3第6天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/33/32/33/33/33/33/33/33/3第7天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/33/32/33/33/33/33/33/33/3培养结果2/33/33/33/33/31/32/33/33/33/3计数菌数（CFU)1,03,412.1816.161,00,00,06,42,24,8结果表明：酪胨琼脂培养基对金黄色葡萄球菌的最小检出量为3CFU、对铜绿假单胞菌的最小检出量为2CFU。5.3葡萄糖蛋白胨培养基最小检出量实验结果按照4.2的实验方法，确定白色念珠球菌在酪胨琼脂培养基中的最小检出量，结果见表8。表8白色念珠菌在葡萄糖蛋白胨培养基中的最小检出量时间白色念珠菌最终接种菌数（CFU）12451025℃25℃25℃25℃25℃第1天（+）0/30/30/30/30/3第2天（+）0/30/30/30/30/3第3天（+）1/33/33/33/33/3第4天（+）1/33/33/33/33/3第5天（+）1/33/33/33/33/3第6天（+）1/33/33/33/33/3第7天（+）1/33/33/33/33/3观察结果1/33/33/33/33/3计数菌数（CFU)0，00，01，01，13，3结果表明：葡萄糖蛋白胨培养基对白色念珠球菌的最小检出量为1CFU。结论与分析1.理论接种菌落数与同步计数菌落数差异问题根据实验结果可以看出，理论接种菌落数与同步计数菌落数有一定差异，其中以铜绿假单胞菌差异最大。目前还未找到原因。因为同步计数菌落数比理论菌落数更加接近实际的菌落数，因此最小检出量以同步计数菌落数来计算。2.最小检出量的管数判定问题在实验过程中，每个稀释度均接种3个对应的培养基小管，在培养结束后判定实验结果时，是按照3/3全部污染为标准。可是菌落数较少的稀释度并不是均不污染，而是污染2/3、1/3管。根据此现象，推测是因为细菌在样品中数量太少，而接种时只吸取0.2ml接种，若0.2ml里有菌落，则能够检出；若0.2ml里刚好没有吸到菌落则检不出来。因此，若认为每次接种均能够吸取菌落，则按照实验结果，则每一种培养基的最小检出量均为1个CFU。名称质控菌3/3管最小检出量2/3管最小检出量1