酶的分离和纯化

第二章酶的分离和纯化

IsolationandPurificationofenzyme

方法概括

原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀或其他方法细分级：一般采用离子交换层析、凝胶层析、亲和层析和电泳

1.2.

第一节

原料选择及预处理

动物原料：动物组织或脏器（活体取出）

充分脱血

-10℃—-50℃保存植物原料：植物原料

磨碎

加入缓冲液抽提植物原料特点：1）纤维含量高

2）酚酶活力高

3）缓冲液pH易被细胞内物质改变微生物原料：菌体培养

做酶活—时间曲线

确定最大酶活时间

3.

细胞破碎

微生物细胞破碎一般采用

1）化学法：碱；去垢剂；有机溶剂；酶解；冰冻复融2）物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡3）机械法：加磨料；研磨；挤压4）缓冲液抽提抽提缓冲液的加入要少量多次，植物酶抽提时可加5mM的Vc4.

第二节酶的粗提沉淀

核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉淀，离心除掉（b）加入核酸酶将其降解杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异选择性沉淀（盐析）：最常用的方法5.沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力

讨论：（a）盐的加入速度合适（b）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关（c）硫铵浓度表示法；饱和度25℃4.1M（d）硫铵饱和溶液pH<7，若目的酶易酸变性必须用缓冲液（e）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩6.

透析与浓缩

1）透析袋处理：透析袋

0.5MEDTA煮半小时

蒸馏水煮半小时

反复八次

带橡皮手套用镊子拿取2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透析液；监测电导值SephadexG25除盐：柱长50cm；上样小于床体积的20%3）浓缩：a）火棉胶

b）聚乙二醇（PEG）

c）超滤（3-5kg/cm2）d）冻干7.

透析技术原理图8.

超滤技术原理图

9.

第三节酶的精制

一、层析技术（chromatography）1）分配层析：物质在两相中的分配系数不同a）纸层

b）薄层(比纸层灵敏100倍但剥板困难)c）柱层2）吸附层析（absorptionchromatography）：吸附剂对通过它的物质吸附力不同，吸附力包括离子引力、疏水作用、范德华力和氢键a）薄层

b）柱层填料一般为硅胶、氧化铝、磷酸钙、活性白土和羟基磷灰石；常用羟基磷灰石;带正电,稳定范围pH5.5-10,吸附量1mg/g湿剂10.

纸层11.

薄层12.3）离子交换层析（ionexchangechromatography）

：交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离a）阳离子交换层析

b）阴离子交换层析

c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂CM-Cellulose、CM-Sephadexe）离子交换剂的预处理：去杂质；溶胀；除小颗粒；改型阳离子交换剂：

碱→水→酸→水→平衡阴离子交换剂：

酸→水→碱→水→平衡13.f）柱层析：床体积等于2-5倍束缚样品需要量；

径∶高

=1∶15；

上样量不超过柱体积的10%（*注意上样方法）；洗脱方法有两种——不连续梯度洗脱和连续梯度洗脱；分布收集器收集每管2-3mlg）交换剂后处理：饱和NaCl→水→酸或碱→水→平衡14.

连续梯度洗脱梯度混合器

15.

离子交换层析阳离子交换剂阴离子交换剂16.Anionexchangechromatography

17.4）凝胶层析（分子筛层析）（gelfiltrationchromatography）：根据分子量大小予以分离

a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌↓

加热90-100℃（水浴加热）b）层析柱准备：φ2.5×100柱；稠胶灌柱；2-3个床体积的缓冲液平衡；流速16-18ml/hc）层析：兰葡聚糖（分子量2×106）验柱并求外水体积（V0）；上样量1-5%；恒压洗脱；流速16-18ml/hd）凝胶后处理：0.5NNaOH+0.5NNaCl处理后4℃保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存18.

凝胶过滤层析原理图

19.

Gelfiltrationchromatography

20.5）亲和层析（affinitychromatography）

特异性结合a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球c）配体的选择：有亲和力但不易过大d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法；包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去）e）

吸附剂的衍生物：支持物+空间臂f）

层析条件的选择：蛋白质+配体→蛋白质-配体复合物起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性），故亲和力较低也能成功的亲和。

g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件21.

亲和层析原理22.Affinitychromatography

23.二、超离心技术

利用物质的沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离F=w2r（F—

相对离心力RCF；RCF以g的倍数表示）

RCF=w2r/980w=π(转数/分）/30RCF=1.119×10-5r(转数/分)2离心机：a)

桌式：3000转/分红血球、酵母细胞等粗沉淀物b)

高速离心机：20000–25000转/分一般实验使用但病毒、小细胞器或单个分子不能沉降c)

超速离心机：75000转/分分子生物学必备；能分级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器24.

二、电泳（electrophoresis）技术

1）原理：M=dL/EtM:迁移率

L:颗粒泳动距离

t:通电时间

E:电势差迁移率与下列因素有关：a）样品带电状态、分子形状与大小

b）电场强度c）缓冲液pH的和离子强度

d）支持介质的阻力、吸附作用2）电泳类型：a）纸电泳

b）醋酸纤维薄膜电泳

c）琼脂糖电泳

d）聚丙烯酰胺凝胶电泳25.PAGE和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：Acr+Bis；TEMED，0.4%；过硫酸胺,0.01-0.03%；等电聚焦(isoelectricfocusing)：两性电解质在电场作用下建立一个pH梯度分离蛋白质电泳检测：a）考马斯亮兰（氨基黑）染色法

b）荧光染色法

c）特异酶检测

d）其他染色法26.

盘状电泳（A）和平板电泳（B）

27.

第四节提纯过程中的定量

蛋白质浓度：1）双缩脲法：Cu++与肽键及酪氨酸残基络合显色；测定浓度0.5-10mg/ml2）Lowry法：双缩脲法的改进，Cu++与蛋白质在碱性溶液中络合，此络合物还原Folin试剂，测定浓度20-400μg/ml3)紫外吸收法：Tyr、Trp、

Phe在280nm有最大光吸收，此方法因上述三种氨基酸含量不同测定结果有误差

测定浓度0.1-0.5mg/ml4）Bradford法:该法是根据蛋白质与考马斯亮蓝（coomassiebrilliantblue）结合产生的蓝色物质在595nm有最大光吸收来测定蛋白质浓度的。该方法简单、快速、可靠、灵敏度高，可测定1-10mg的蛋白质。酶活力：检测目的酶的活力目的蛋白（非酶）检测较困难28.纯化倍数

=回收率%=×100

29.

酶的提纯过程记录格式

步骤总体积（ml）蛋白总量（mg）总活力（u）比活力（u/mg）回收率（%）提纯倍数粗抽提液

50℃热变性除杂

硫铵分级沉淀（30%-50%）

DEAE-纤维素离子交换

凝胶过滤SephadexG-1001000

1000

250

25

1012000

8000

750

35

9.25000

48000

2730

1820

17000.416

0.80

3.67

52

185100

96

55

36.4

341.00

1.44

8.83

125

44430.第五节酶蛋白分子量的测定渗透压法

超速离心法凝胶层析法

SDS-聚丙烯酰胺电泳法

31.

渗透压法M为蛋白质的摩尔质量（分子量），R为气体常数（0.082升·大气压/摩尔/度），T为绝对温度。为了测定蛋白质的分子量，分别取几个不同的蛋白质浓度c，测出对应的渗透压π，然后以π/c对c作图，并作延长线外推至c=0，得到的y轴截距即为limπ/c的值，代入上式可求得分子量M。渗透压法适合测定分子量范围在10,000～100,000的蛋白质。其优点是实验装置简单，测定也较为准确；缺点是要求蛋白样品纯度高，否则测出的将是溶液中各种蛋白的平均分子量。32.

超速离心法M：分子量

S：沉降系数

R：气体常数

T：绝对温度

D：扩散系数

υ：溶质分子微分比容ρ：介质密度33.

SDS-聚丙烯酰胺电泳法M——

被测蛋白分子量a，b——

常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得

de——

酶蛋白的泳动距离

do——

小分子染料的泳动距离亚基分子量34.SDS的分子量标准曲线

35.

凝胶层析法M——

被测蛋白分子量a，b——

常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得

Ve——

酶蛋白洗脱体积

Vo——

空体积（可用蓝葡聚糖求得）36.

凝胶过滤分子量标准曲线

37.思考题下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数。⑴．从表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶液的比活；⑵．哪一纯化步骤最有效（即相对纯度增加最大）；⑶．哪一纯化步骤效率最低？按照表中的6个步骤纯化的酶是纯化的酶，表中结果是否有指示？有没有别的方法评价酶的纯度？

38.39.作业请说明酶纯化过程中常用的分离技术。从肝细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化步骤以后得到的4mL酶制品（含有0.08mg蛋白），总活力为288单位。整个纯化过程的收率是多少？纯化了多少倍？40.后面内容直接删