公司培训液相色谱教程

主要内容一、高效液相色谱法简介二、高效液相色谱系统三、高效液相色谱法分类四、HPLC使用注意事项高效液相法色谱简介高效液相色谱法的发展高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)起始于60年代后期，是在经典液相色谱法的基础上引入了气相色谱理论而迅速发展起来的一种分离分析方法。HPLC法的分离原理溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，与固定相(stationaryphase)发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，由于不同组分理化性质不同，与固定相发生作用的大小、强弱不同，导致在固定相中滞留时间不同，从而先后流出色谱柱。高效液相色谱仪的结构流程高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱高效液相谱系统输液泵

输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应＜0.5%；②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。一个输液泵只能控制一个输液瓶，即只能用一种溶剂（单一或混合溶剂）进行洗脱（等度洗脱）。由于等度洗脱用的流动相组成始终保持恒定，所以只适合组分数目少，性质差别不大的样本的分离。一元泵系统

对于组分多、性质差别大的复杂样本在一个条件下难以将各个组分洗脱下来，如在一个分析周期内按程序改变流动相的组成（如极性、离子强度和pH值)，使各组分在适当条件下得到分离。二元泵系统

在一个分析周期内依据被测组分的极性而按程序改变流动相组成进行洗脱的方法叫做梯度洗脱。优点：能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形。缺点：基线漂移。在不同仪器或色谱柱上较难重现。高压/低压梯度洗脱系统及特点由两台以上输液泵将两种以上溶剂分别送入混合器混合，然后进入色谱柱的洗脱方式称为高压梯度洗脱。特点：梯度准确度好。由一台输液泵通过比例阀和在线脱气机完成的梯度洗脱方法称为低压梯度洗脱。特点：需要配备在线脱气机，易发生时间滞后效应。现在的HPLC输液泵多用柱塞往复泵，它的液缸容积可小至0.1ml，易于清洗和更换流动相，特别适合于梯度洗脱，而且由于改变电机转速就能方便地调节流量，所以流量不受柱阻影响，输液泵压力可达400kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，双泵系统较好地克服了输出脉冲性较大的缺点。按双泵的连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1%左右，串联泵为0.2~0.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。溶剂的纯度要高，否则重现性差；梯度混合的溶剂互溶性要好；进样之前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂峰；每次梯度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡，使之回到流动相组成的初始浓度。示差折光检测器对流动相组成变化敏感，不能进行梯度系统。梯度洗脱注意事项检测器检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。根据检测原理可将其分为选择性检测器和通用型检测器。检测器选择性紫外(VWD、DAD)荧光电化学通用型示差折光蒸发光散射质谱几种常用检测器的主要性能UV荧光电化学质谱蒸发光信号流速影响温度影响检测限(g/ml)池体积(µl)梯度洗脱样品破坏吸光度无小10-102~10适宜无荧光强度无小10-132~7适宜无电流有大10-13＜1不宜无离子流强度无––适宜有散射光强无小10-9––适宜无检测器的保养紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时打开检测器，20分钟后可以进行检测；在分析完闭后，先关紫外灯。（频繁的开关灯会缩短灯的使用寿命）样品池要常清洗柱温箱HPLC分析一般在室温条件下进行,但适当提高柱温能降低流动相黏度和柱前压，有利于改善传质和提高分析速度，有利于提高保留时间的重现性。高效液相色谱分类方法与特点

HPLC分类根据固定相可以分为：液-固色谱、液-液色谱及键合相色谱；根据分离原理可以分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、离子对色谱、排阻色谱等。键合相色谱分离原理：认为吸附、分配兼有之。正相色谱：采用极性固定相（如硅胶、氨基与腈基键合相），流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。

离子交换色谱：固定相是离子交换树脂。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

改变流动相的pH值和离子强度可以改善分离。排阻色谱法

固定相为有一定孔径的多孔性填料。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。离子对色谱法主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。反相离子对色谱法常用ODS柱，流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保留时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。三、HPLC使用注意事项HPLC的日常操作条件最好是恒温、恒湿温度：15~30℃

相对湿度<80%房间应有良好的通风空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器避免光线直射远离高电干扰、高振动设备

（一）启动前检查

1.流动相是否过滤2.水与有机溶剂混合时温度变化大，必须待恢复到室温时方可使用，否则易产生气泡。3.更换流动相时注意两种流动相必须具有互溶性，更换溶剂的一般方法：（1）取少量准备更换的流动相放在清洁的烧杯中，取出吸滤器，将吸滤头放在烧杯中用超声波振荡器振动清洗干净；（2）打开排液阀，按清洗键（purge），用新流动相清洗泵中的流动相；（3）关闭排液阀，启动泵，清洗流路；（4）连接色谱柱和检测器，用新流动相平衡色谱柱。4.更换不互溶性流动相时应先用异丙醇进行置换，然后每步都按（1）~（4）进行。5.更换缓冲盐流动相时，用纯水清洗，每步都按1~4进行。6.保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洗；用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。7.定期在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器，保持过滤器畅通无阻。8.每天开始使用仪器时注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。开机或更换流动相时应从0.2ml/min开始，待压力稳定后再升高流速，每次0.2ml（二）泵的使用与维护注意事项1.防止任何固体微粒进入泵体（0.2um或0.45um的微孔滤膜过滤）。2.流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性。3.流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内。4.泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转会磨损柱塞、密封圈，导致漏液。5.输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形造成漏液。6.使用缓冲液后用两通管连接管路及检测池，先用纯水冲洗，然后用甲醇冲洗。管路及检测池冲洗干净后再冲洗色谱柱。反相柱先用含5%~7%甲醇的水冲洗色谱柱（此时不要再连接检测池），然后用甲醇或甲醇-水混合液冲洗。7.缓冲盐不得在色谱柱中过夜。8.缓冲液使用前必须过滤。9.磷酸盐、乙酸盐缓冲液易受到细菌和霉菌的影响，不得放置过夜，应临用现制。注意：用缓冲液后不能直接换用有机溶剂流动相的贮存流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能贮存在塑料容器中。容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。容器应定期清洗，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。1.使用流动相溶解样品--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要

--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀2.进样前最好使用<0.45um的膜进行过滤。样品处理

手动进样阀操作注意点：1）样品溶液必须用0.45um的滤膜过滤2）进样应使用液相色谱专用平头进样针3）转动阀芯时不能太慢，更不能停留在进样阀的中间位置4）常用密封垫的材质适用pH<10,样品溶液pH小于10,换特氟隆材质的密封垫pH10-135）每天分析工作结束后，要清洗进样阀定子转子针头密封垫弹簧不锈钢套进样阀的保养色谱柱的保养8945612370xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:::::::输液时不要打开排液阀柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净要注意流动相的脱气避免使用高粘度的溶剂作为流动相进样样品要提纯控制绝对进样量加预柱预柱预柱套预柱芯

预柱套预柱芯装色谱柱时应按色谱柱上的箭头方向安装。一般不要倒冲色谱柱。每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱,清洗后塞住两头当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存注意：只能使用色谱级的溶剂!

不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液流动相的选择采用“HPLC”级溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配（质谱、ELSD不能用无机盐缓冲液、用UV检测器时注意溶剂的截止波长分析过程中常见故障

及解决方法被污染的溶剂吸滤头产生的问题故障特征：“鬼峰”保留时间不断改变(由于过滤头堵塞或部分堵塞)清洗步骤：1.水；2.稀硝酸； 3.水；4.异丙醇；5.水注意：砂芯式滤头不能超声流路中形成气泡引起的问题改变保留时间和峰面积

由于流动相中形成气泡对液流的不良影响及泵中形成气泡使液流波动峰变形柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声输液泵常见故障及相应排除措施故障

可能原因

解决办法

无流动相流出，又无压力指示泵内有大量气体打开泄压阀，排液密封圈损坏更换压力和流量不稳有气泡打开泄压阀排液单向阀内有异物稀硝酸超声清洗压力高堵压力低漏按规则操作尽量避免问题

如出现问题应尽快预测可能出现的问题的原因，一次仅改变一种因素有助于正确判断问题所在的原因对自己所做的故障排除工作作好记录!使用HPLC时注意气相色谱法简介一、色谱知识简介二、气相色谱仪器简介主要内容气相色谱知识简介

GC:用气体作为流动相的色谱法，利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离优点:选择性高、分离效率高、灵敏度高、分析速度快缺点:仅适于蒸汽压低,沸点低的样品GC分类：按色谱柱分：填充柱GC和开管柱GC（毛细管柱）按固定相分：气固色谱和气液色谱按分离机理分：分配色谱和吸附色谱按进样方式分：常规色谱，顶空色谱和裂解色谱等

1.气固色谱：吸附机理；如永久性气体：CO、CO2、N2、O2等。

2.气液色谱：分配机理；适用于较低分子量和低沸点且350℃不易分解的物质组分的分离分析。，另外对于难挥发的物质可以采用衍生化法使其沸点降低，如高级醇、高沸点酸可以通过酯化使其生成对应的酯。气相色谱仪的基本配置简介气路系统进样系统色谱柱系统检测系统数据处理系统气路系统气源钢瓶／发生器气路控制系统减压阀流量调节器氢气和氮气不允许用完，当瓶内压力低于500kPa时即应停止使用。气体流路连接净化管，管中可以装填5A分子筛，以便吸附气源中微量水和低分子量的有机杂质。在管内5A分子筛之后装入少量变色硅胶。当分子筛失效不能吸收水分时，水开始被变色硅胶吸收，硅胶由蓝变红说明分子筛需要重新活化。5A分子筛的活化方法是在500一600℃(不应超过600℃)加热2—3h，或在真空下130℃加热1h。变色硅胶在120℃加热活化。净化管入口和出口应加标志，出口应当用少许纱布、脱脂棉轻轻塞上，严防净化剂粉尘流出净化管吹进色谱仪。有时在净化管里还加入活性炭，以吸附分子量较大的有机杂质。进样系统进样口汽化室（<400℃，死体积小，惰性）进样方式手动进样