HPLC-ICP-MS分离硒代半胱氨酸

刘琛：HPLC-ICP-MS分离硒代半胱氨酸HPLC-ICP-MS分离硒代半胱氨酸摘要作为人体必需的微量元素，硒有至关重要的生理作用，包括抗氧化、抗癌等，硒也参与动物和植物的生命活动。其中，在人体和动物体内利用率最高的硒化合物是硒代半胱氨酸，然而由于不稳定、缺乏标准品，而难于进行研究和生产利用，无机硒相对有机硒生物利用率低，却是富硒产品中常见的添加剂。若能准确分离和定量分析硒代半胱氨酸，将有益于对其在生命活动中的角色深入探讨，为高效补硒提供依据。关于硒的形态分析，在无机硒方面已趋于成熟，AAS、AFS、MS均有利用，在有机硒方面则遇到困难，主要在于有机硒种类多、某些形态缺乏标准品，且常处于超痕量级。硒代半胱氨酸是硒代胱氨酸在生物体内参与反应后转化的一种形态，只存在于生物体内。本实验采用硒代胱氨酸还原法制备硒代半胱氨酸，选用二硫苏糖醇为还原剂，并优化了硒代胱氨酸溶液中甲醇含量，加入过量二硫苏糖醇以增大转化率。本实验采用HPLC-ICP-MS联用技术，其分离效能高，检出限低，满足硒代半胱氨酸的测定要求。选用78Se进行检测，阴离子色谱柱，优化了流动相pH及浓度的影响，最终实现将硒代半胱氨酸与SeMet、L-SeMC、Se[IV]、Se[VI]分离并定量分析。本实验建立的方法有利于对硒代半胱氨酸的功能进行深入探讨，探究及优化的过程为分析缺乏标准品的有机活性物质提供了启发。关键词：硒形态分析；硒代半胱氨酸；HPLC-ICP-MS；定量分析AbstractAsanessentialmicronutrient,seleniumhasvitalbiologicalfunctions,includingfightingagainstoxidationsandcancers,andisalsoinvolvedinanimalandplantlife.Amongthem,theSeleniumcompoundwiththehighestutilizationrateinhumanandanimalbodyisselenocysteine.However,duetoinstabilityandlackofstandardsamples,itisdifficulttostudyandproduce.Inorganicseleniumislowerthanorganicbioavailabilitybutit'sacommonadditiveinselenium-richproducts.Ifwecanaccuratelyseparateandquantitativelyanalysisselenocysteine,itwillbebeneficialtofurtherexploreitsroleinlifeactivities,andprovideabasisforeffectiveseleniumsupplementation.Thespeciationanalysisofseleniumismatureininorganicselenium,AtomicAbsorptionSpectroscopy,AtomicfluorescenceSpectroscopyandMassSpectrumhaveallbeenused.Butit'sdifficulttoanalyseorganicselenium,mainlybecausethattherearemanykindsoforganicselenium,somespeciationofwhicharelackofstandardsamples,andorganicseleniumareofteninsuper-tracelevel.Selenocysteineisaformthatparticipatesintheconversionofselenocysteineinlivingorganismsandisfoundonlyinlivingorganisms.Inthisstudy,selenium-containingcystinewasusedtoproduceselenocysteine,Dithiothreitolwasusedasreductant.Themethanolcontentinselenocystinesolutionwasoptimized,andtoincreasetheconversionratefurther,excessivedithiothreitolwasadded.Inthisexperiment,MassSpectrumwithInductivelycoupledplasmaandHigh-performanceLiquidChromatographywasused.Becausetheseparationefficiencywashigh,thedetectionlimitwaslow,anditcouldmeettherequirementsofselenocysteinedetermination.78Sewasusedfordetection,andanionchromatographiccolumnwasusedtooptimizetheeffectofpHandconcentrationofmobilephase.Finally,theselenocysteinewasseparatedfromSeMet,L-SeMC,Se[IV],Se[VI]anditsquantitativeanalysissucceeded.ThemethodestablishedinthisstudyisbeneficialtothefurtherstudyofthefunctionofSelenocysteine,andtheprocessofexplorationandoptimizationprovidesinspirationfortheanalysisoforganicactivesubstanceslackingofstandardproducts.Keywords:speciationanalysisofselenium;selenocysteine;HPLC-ICP-MS;quantitativeanalysis目录第一章绪论 11.1硒的研究背景 11.1.1硒的存在形式 11.1.2硒的生理功能 11.1.3硒在人体的需要量 21.2硒的形态分析方法 31.2.1硒的形态分析方法 31.2.2HPLC-ICP-MS联用技术 51.3研究内容及意义 61.3.1研究内容 61.3.2研究意义 6第二章HPLC-ICP-MS分离硒代半胱氨酸 72.1试剂及仪器 72.1.1试剂 72.1.2仪器 72.2实验步骤 82.2.1仪器条件 82.2.2试样配制 9第三章结果与分析 113.1不同形态硒保留时间的确定 113.2实验条件的优化 133.2.1SeCys制备过程的优化 133.2.2色谱分离过程的优化 153.3分离硒代半胱氨酸 193.3.1分离度 203.3.2SeCys定量 203.3.3L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]定量 213.4实验过程的不足与改进 23第四章结论与展望 24致谢 24参考文献 25第二章HPLC-ICP-MS分离硒代半胱氨酸2.1试剂及仪器2.1.1试剂表1试剂试剂名称摩尔质量(g/mol)规格生产厂家L-硒代胱氨酸(SeCys)2334.0998%中国河北百灵威超精细材料硒代蛋氨酸SeMet196.11-加拿大TorontoResearchChemicalsL-硒-甲基硒代半胱氨酸L-SeMC182.08≥98.0%日本东京化成工业四价硒标准储备溶液(1000μg/mL)--美国InorganicVentures六价硒标准储备溶液(878μg/mL)--美国InorganicVentures二硫苏糖醇DTT154.2599%中国河北百灵威超精细材料甲醇32.04优级纯德国默克柠檬酸铵243.22分析纯中国上海沪试一水合柠檬酸210.44分析纯中国上海沪试2.1.2仪器表2仪器仪器名称型号生产厂家电感耦合等离子体质谱仪7900美国Agilent高效液相色谱仪1260InfinityⅡ美国Agilent色谱柱HamiltonPRP-X100美国Agilent电子天平BT125D德国sartorius水纯化系统ThermoFisherBarnstead美国ThermoScientific移液枪(20uL,200uL,1000uL,10mL)ResearchPlus德国eppendorfpH计100A美国EcoSense微孔过滤膜0.45um,50mm，有机系中国津腾循环水真空泵SHZ-Ⅲ中国上海亚荣生化仪器水浴恒温振荡器SHZ88A中国常州诺基仪器2.2实验步骤2.2.1仪器条件(1)HPLC条件表3HPLC条件流量(mL/min)1.000进样体积(uL)100.00色谱柱HamiltonPRP-X100(2)ICP-MS条件硒有82Se,80Se,78Se,77Se,76Se,74Se共六种天然同位素。其中丰度最大的80Se由于受到Ar2在m/z=80的干扰而不能用于检测；77Se的信噪比较差[22]；而82Se,76Se,74Se的丰度太小，响应信号小，达到检测灵敏度较为困难；丰度23.7%的78Se虽然受到40Ar38Ar+的干扰，但采用碰撞反应池技术即可打散多原子离子[23,24]，消除干扰，故本实验采用碰撞反应池、选用78Se进行检测。表4ICP条件参数参数值RF功率(W)1550RF匹配(V)1.80采样深度(mm)10.0载气(L/min)1.08蠕动泵(rps)0.40表5ICP-MS条件参数参数值m/z78氩气压力(kPa)650载气压力(kPa)320等离子体气体(L/min)15.00辅助气(L/min)1.000载气(L/min)1.000补偿气(L/min)1.000雾化室温度(℃)22.002.2.2试样配制(1)配制流动相准确称取0.1216g柠檬酸铵于50mL烧杯中，加入超纯水溶解，转移至1000mL容量瓶，少量超纯水润洗3次，加入用量程10mL移液枪准确移取两次的共20mL甲醇，超纯水定容至刻度，振荡，即配得含2%甲醇的5mmol/L柠檬酸铵溶液，pH计测定pH，加入适量一水合柠檬酸溶液(称取约2g一水合柠檬酸，溶于约10mL超纯水)，调pH至4.4，在循环水真空泵抽滤，过0.45um,50mm，有机系微孔过滤膜，即配得流动相。EcoSense100A型号pH计使用方法：使用前先校准，开机，将玻璃电极置于中性标准溶液，按下STAND键，待示数稳定变为HOLD,测得pH为7左右，再将玻璃电极置于酸性标准溶液，按下SLOPE键，待示数稳定变为HOLD,测得pH为4左右，将玻璃电极从溶液取出，长按MEASURE键5秒，显示校准曲线的相关系数在(100±5%)即可。测pH时将玻璃电极置于待测溶液，按下MEASURE键，即显示pH。(2)配制含Se浓度为2umol/L单标溶液准确称取0.00334g(SeCys)2于20mL烧杯中，加入超纯水溶解，转移至100mL容量瓶，少量超纯水润洗5次，超纯水定容至刻度，振荡，即配得100umol/L(SeCys)2溶液，备用。用量程1000uL移液枪准确移取1000uL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超纯水定容至刻度。即配得1umol/L(SeCys)2溶液，含Se浓度为2umol/L。准确称取0.00392gSeMet于20mL烧杯中，加入超纯水溶解，转移至100mL容量瓶，少量超纯水润洗5次，超纯水定容至刻度，振荡，即配得200umol/LSeMet溶液，再用量程1000uL移液枪准确移取1000uL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，即配得2umol/LSeMet溶液，含Se浓度为2umol/L。准确称取0.00364gL-SeMC于20mL烧杯中，加入超纯水溶解，转移至100mL容量瓶，少量超纯水润洗5次，超纯水定容至刻度，振荡摇匀，即配得200umol/LL-SeMC溶液，再用量程1000uL移液枪准确移取1000uL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，即配得2umol/LL-SeMC溶液，含Se浓度为2umol/L。用量程200uL移液枪准确移取100uL四价硒标准储备溶液(1000μg/mL)于15mL含盖离心管，加入用量程10mL移液枪准确移取的6mL超纯水,振荡摇匀，即配得200umol/L四价硒溶液，再用量程1000uL移液枪准确移取1000uL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，即配得2umol/L四价硒溶液，含Se浓度为2umol/L。用量程200uL移液枪准确移取10uL六价硒标准储备溶液(878μg/mL)于15mL含盖离心管，加入用量程10mL移液枪准确移取的5340uL超纯水,振荡摇匀，即配得200umol/L六价硒溶液，再用量程10mL移液枪准确移取10mL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，即配得2umol/L六价硒溶液，含Se浓度为2umol/L。(3)配制含Se浓度为8umol/L混标溶液将(1)中配得的100umol/L(SeCys)2溶液、200umol/LSeMet溶液、200umol/LL-SeMC溶液、200umol/L四价硒溶液、200umol/L六价硒溶液分别用量程1000uL移液枪准确移取四次共4000uL于100mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，即配得含Se浓度为8umol/L的混标溶液。(4)配制浓度为100mmol/LDTT溶液准确称取0.15425gDTT于15mL含盖离心管，加入用量程10mL移液枪准确移取的10mL超纯水,振荡，即配得浓度为100mmol/LDTT溶液。(5)配制含30%甲醇的柠檬酸铵溶液准确称取0.1216g柠檬酸铵于50mL烧杯中，加入超纯水溶解，转移至250mL容量瓶，少量超纯水润洗3次，超纯水定容至刻度，振荡，即配得20mmol/L柠檬酸铵缓冲液。用量程10mL移液枪准确移取七次共70mL20mmol/L柠檬酸铵缓冲液于250mL锥形瓶，加入用量程10mL移液枪准确移取三次共30mL甲醇，振荡，即配得含30%甲醇的14mmol/L柠檬酸铵的溶液，备用。(6)制备SeCys准确称取0.00334g(SeCys)2于20mL烧杯中，加入(5)中混合液溶解，转移至100mL容量瓶，少量(5)中混合液润洗5次，再加(5)中混合液定容至刻度，振荡，即配得含甲醇的100umol/L(SeCys)2溶液，备用。用量程1000uL移液枪准确移取上述制备的100umol/L(SeCys)2溶液1000uL两次共计2mL于15mL含盖离心管，再加入用量程100uL移液枪准确移取的28uL配制的浓度为100mmol/LDTT溶液，振荡摇匀，放入水浴恒温振荡器恒温37℃2h，静置冷却至室温，即制得200umol/LSeCys溶液，其中含有过量未反应的DTT约1.2mmol/L。用量程1000uL移液枪准确移取上述溶液250uL于25mL容量瓶，少量超纯水润洗5次，超纯水定容至刻度，振荡，即配得2umol/LSeCys标准溶液。配制含SeCys的浓度为8umol/L混标溶液将(6)中反应后冷却的200umol/LSeCys溶液、200umol/LSeMet溶液、200umol/LL-SeMC溶液、200umol/L四价硒溶液、200umol/L六价硒溶液分别用量程1000uL移液枪准确移取四次共4000uL于100mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，即配得含Se浓度为8umol/L的混标溶液。第三章结果与讨论3.1不同形态硒保留时间的确定单标测定结果如下图所示。由图1可知，该条件下(SeCys)2保留时间为2.285min，含Se浓度为2umol/L时峰面积为304636。图1(SeCys)2由图2可知，该条件下SeMet保留时间为6.094min，含Se浓度为2umol/L时峰面积为28320。图2SeMet由图3可知，该条件下L-SeMC保留时间为3.055min，含Se浓度为2umol/L时峰面积为33277。图3L-SeMC由图4可知，该条件下Se[IV]保留时间为3.526min，含Se浓度为2umol/L时峰面积为22506。图4Se[IV]由图5可知，该条件下Se[VI]保留时间为10.824min。图5Se[VI]图5中有两个峰的原因是Se[VI]不稳定，在溶液中部分还原为Se[IV]，且本实验2.2.2（7）步骤基体中含有过量的DTT有还原性，故分离分析Se[VI]、Se[IV]较困难，本实验混标测定定量时将二者共同分析，即Se[VI]、Se[IV]含Se浓度为4umol/L时峰面积为44148。由上述五图可知，(SeCys)2、SeMet、L-SeMC、Se[IV]、Se[VI]的保留时间及先后顺序为：(SeCys)22.285min，L-SeMC3.055min，Se[IV]3.626min，SeMet6.094min，Se[VI]10.824min。3.2实验条件的优化3.2.1SeCys制备过程的优化对反应体系中甲醇含量进行优化。在前述2.2.2步骤(6)中用不含甲醇的14mmol/L柠檬酸铵溶液溶解配制(SeCys)2，测定结果如图6所示。图6不含甲醇的14mmol/L柠檬酸铵溶液(SeCys)2转化率达到90%，但(SeCys)2与生成的SeCys未达到基线分离。在前述2.2.2步骤(6)中用含15%甲醇的14mmol/L柠檬酸铵溶液溶解配制(SeCys)2，测定结果如图7所示。图7含15%甲醇的14mmol/L柠檬酸铵溶液(SeCys)2与生成的SeCys依旧未达到基线分离，转化率超过99%，未反应的(SeCys)2浓度小于0.02umol/L。在前述2.2.2步骤(6)中用30%含甲醇的14mmol/L柠檬酸铵溶液溶解配制(SeCys)2，测定结果如图8所示。图8含30%甲醇的14mmol/L柠檬酸铵溶液只有生成的SeCys的峰，认为转化率达到100%，且峰形较为对称。SeCys保留时间为2.551min，浓度为4umol/L时峰面积为24207。考虑到甲醇含量升高对(SeCys)2溶解性的影响，甲醇含量超过30%时，在水浴恒温振荡器恒温37℃2h不能使(SeCys)2完全溶解，本实验反应体系采用含30%甲醇的14mmol/L柠檬酸铵溶液。3.2.2色谱分离过程的优化(1)流动相pH本实验先以pH分别为7.5,6.5,5.5,4.5的流动相进行混标的分离，混标中(SeCys)2浓度为4umol/L，SeMet、L-SeMC浓度均为8umol/L，Se[IV]、Se[VI]浓度之和为16umol/L，DTT与(SeCys)2的物质的量之比为14:1。流速1mL/min、流动相为含2%甲醇的5mmol/L柠檬酸铵溶液条件下，测定结果如下图所示。由图9、图10、图11、图12的谱图可知，pH=7.5时，(SeCys)2、SeMet出峰且峰形对称，L-SeMC与Se[IV]未分离且有拖尾现象，Se[VI]未出峰；pH=6.5时，Se[VI]可出峰，但L-SeMC与Se[IV]未分离且有拖尾现象；pH=5.5时，L-SeMC与Se[IV]未分离且有拖尾现象，SeMet、Se[VI]峰明显后移，保留时间延长；pH=4.5时，L-SeMC与Se[IV]可分离，五种形态硒可分离，Se[VI]峰后移，保留时间延长至11min后。故一定范围内，随pH降低，L-SeMC与Se[IV]可分离，SeMet、Se[VI]峰有后移。图9流动相pH=7.5图10流动相pH=6.5图11流动相pH=5.5图12流动相pH=4.5pH=4.5时能基本实现对五种形态硒的分离，且峰形较对称，但L-SeMC与Se[IV]未达到基线分离，故在pH=4.5附近范围内进一步优化实验。以pH分别为5.0,4.7,4.3的流动相进行混标的分离。由图13谱图可知，pH=5.0时，L-SeMC与Se[IV]分离度较差，L-SeMC与Se[IV]间未达到基线分离，且(SeCys)2与L-SeMC和Se[IV]之间拖尾明显。图13流动相pH=5.0由图14、图15谱图可知，pH=4.7和4.3时，L-SeMC与Se[IV]间达到基线分离，且(SeCys)2与L-SeMC和Se[IV]之间拖尾减轻。随着pH降低，L-SeMC与Se[IV]分离度增大，峰形趋于对称，但保留时间最大的峰即Se[VI]对应的峰保留时间明显延长，pH=4.3时已延长至超过12min。图14流动相pH=4.7图15流动相pH=4.3综上所述，综合考虑到pH对出峰、基线、峰形、保留时间的影响，pH=4.7为最优流动相pH，此时五种形态硒均出峰，基线平稳，峰形对称，保留时间在12min以内。流动相浓度制备SeCys时，反应体系采用含30%甲醇的14mmol/L柠檬酸铵溶液，色谱分离时分别采用浓度2mmol/L、4mmol/L含2%甲醇的柠檬酸铵溶液作为流动相，谱图如下图16、图17所示。图16含2%甲醇的2mmol/L柠檬酸铵溶液图17含2%甲醇的4mmol/L柠檬酸铵溶液由图16、图17可知，流动相含2%甲醇的柠檬酸铵溶液浓度较低时，各峰延后，保留时间延长，且基线不平稳。由于仪器限制，流动相含2%甲醇的柠檬酸铵溶液浓度为6mmol/L时，仪器无法负荷，导致ICP-MS熄火。综上所述，综合考虑到仪器状况和流动相浓度对基线、峰形、保留时间的影响，本实验选用含2%甲醇的5mmol/L柠檬酸铵溶液作为流动相。3.3分离硒代半胱氨酸混标分离测定结果如图18所示。图18分离硒代半胱氨酸3.3.1分离度分离度公式：五种形态硒的保留时间及半峰宽如表6所示。表6半峰宽形态保留时间/min半峰宽/minSeCys2.4500.351L-SeMC3.0210.216SeMet3.5840.229Se[IV]5.1360.394Se[VI]11.7440.380可得SeCys与L-SeMC之间分离度为R1=2.014，L-SeMC与SeMet之间分离度为R2=2.530，SeMet与Se[IV]之间分离度为R3=4.982，Se[VI]与Se[IV]之间分离度为R4=17.074。分离度均超过1.5，各组分完全分离，实现了SeCys的分离。3.3.2SeCys定量由混标谱图，SeCys浓度8umol/L时峰面积为45582。可依据如下两种方法定量。（1）单点法在该仪器条件、基体条件下，可据此使用单点法定量，对未知样品中SeCys的浓度进行测定。（2）标准曲线法在相同仪器条件、基体条件下，制备SeCys标准品时，SeCys浓度为4umol/L时峰面积为24207，结合混标谱图中SeCys浓度为8umol/L时峰面积为45582，作得SeCys标准曲线如下图19所示。图19SeCys标准曲线Pearson相关系数R2=0.9987，线性相关性较好，在该仪器条件、基体条件下，可依据标准曲线定量，对未知样品中SeCys的浓度进行测定。3.3.3L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]定量在相同仪器条件、基体条件下，L-SeMC浓度为2umol/L时峰面积为33277，结合混标谱图中L-SeMC浓度为8umol/L时峰面积为106218，作得L-SeMC标准曲线如下图20所示。图20L-SeMC标准曲线在相同仪器条件、基体条件下，SeMet浓度为2umol/L时峰面积为28320，结合混标谱图中SeMet浓度为8umol/L时峰面积为85440，作得SeMet标准曲线如下图21所示。图21SeMet标准曲线在相同仪器条件、基体条件下，Se[IV]和Se[VI]混合总浓度为4umol/L时峰面积为28320，结合混标谱图中Se[IV]和Se[VI]混合总浓度为16umol/L时峰面积为85440，作得Se[IV]和Se[VI]标准曲线如下图22所示。图21Se[IV]和Se[VI]标准曲线Pearson相关系数R2均超过0.99，线性相关性较好，在该仪器条件、基体条件下，可依据标准曲线定量，对未知样品中L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]的浓度进行测定。3.4实验过程的不足与改进本实验虽然成功实现对硒的五种不同形态SeCys、L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]进行分离测定，但是实验过程依然存在以下不足之处，并提出对应改进措施。（1）未实现同时定量SeCys和(SeCys)2由于还原硒代胱氨酸(SeCys)2制备硒代半胱氨酸SeCys的过程中，加入的DTT是过量的，DTT无法从混标基体中分离，若在混标中加入(SeCys)2可能被DTT还原为SeCys，从而导致定量分析有较大误差。改进措施主要有以下两点：①消耗剩余DTT。(SeCys)2完全转化成SeCys后，加入某种物质消耗剩余的过量DTT，使之被氧化或络合，而不破坏SeCys，且生成物不影响SeCys与(SeCys)2分离与定量，考虑某些生物活性酶可与DTT发生重组反应而不与SeCys反应，例如肌酸激酶[25]，还有某些可与DTT络合的物质，例如孔雀石绿染料三苯基甲烷与DTT络合生成沉淀[26]，及能氧化DTT而不氧化SeCys的物质，例如某种Pt(Ⅳ)配合物trans-[PtCl2(en)(heda)]Cl2[27]；②特异性标记SeCys。检测未知样品中SeCys时，将SeCys标记，而(SeCys)2不被标记，即可分开测定二者，考虑可与SeCys中裸露的巯基反应的氯化甲基汞[24]，未进行氯化甲基汞标记实验的原因除了过量的DTT未除去之外，还有一个原因是(SeCys)2标准品溶液经测定含有Hg，而仪器未被污染，可能是出厂产品就含有Hg，也可能是外来污染。（2）未实现同时定量Se[IV]和Se[VI]SeCys反应体系中有过量的DTT，Se[VI]可能被还原，其次标准溶液中也存在Se[VI]还原成Se[IV]，且从而导致定量分析有较大误差。改进措施主要也是消耗剩余DTT。加入某种物质消耗剩余的过量DTT，使之被氧化或络合，而不破坏Se[IV]和Se[VI]，且生成物不影响Se[IV]和Se[VI]分离与定量。条件优化不够完善DTT还原硒代胱氨酸(SeCys)2制备硒代半胱氨酸SeCys的实验步骤中，未进一步优化反应温度、反应时间、振荡强度等条件。结论与展望本实验成功制备硒代半胱氨酸SeCys。用含30%甲醇的14mmol/L柠檬酸铵溶液溶解硒代胱氨酸，以过量的DTT还原，二者比例为1:14，认为此条件下转化率接近100%。本实验成功分离测定硒代半胱氨酸SeCys。在含有DTT约1.2mmol/L的基体中，最佳的色谱分离条件下，流动相为含2%甲醇的5mmol/L柠檬酸铵溶液及本实验仪器条件下，SeCys保留时间为2.551min，定量标准曲线相关系数超过0.9987，分离度为2.014.同时也可分离测定其它四种形态的硒，L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]。SeCys缺乏标准品这个问题一直阻碍与其有关的测定和研究，本实验对SeCys的制备为制备稳定、高纯度的SeCys提供了参考。待研制得到SeCys标准品，届时SeCys在人体及动物体内参与的生化反应将有望被系统的研究，硒元素的代谢过程及其与健康的关系将更为明了。本实验中的不足及方法误差，尤其是有关DTT对于硒形态分析的负面影响，有待进一步实验探究，SeCys的制备过程的条件优化也有待完善。致谢首先感谢我的指导老师陈艳玲教授和湖北省疾控中心卫生检验检测研究所的黄文耀主任，在过去的三个月里面与我讨论实验的方向，为我答疑解惑，每当我在实验期间遇到问题时，老师们都会耐心指导，并且引导我去找出新的实验思路。在此，我想衷心的对两位致以最真诚的敬意、感激和祝福！还要感谢湖北省疾控中心的张颖和向倩倩老师，耐心为我讲解色谱、质谱仪器的使用方法及注意事项，我才能顺利按时完成实验。最后，感谢和我一起在湖北省疾控中心卫生检验检测研究所做实验的李璐颖同学，在各自的实验进入瓶颈时相互鼓励，现在都已顺利结束实验。你们让我更加深刻的了解，一个实验课题的完成，既需要物质和技术上的支持，也需要参与的人员之间的信任与配合。还有一个月的时间，我就将从中国地质大学毕业，回首大学时光，我很庆幸。专业上，我对化学学科有了更多的理解，更加了解自己感兴趣的方向，思维渐渐趋于理性。生活中，我遇到了专业、尽责的老师，真诚、朴素的同学，参与了丰富的活动。感谢大学期间遇到的所有人，你们陪伴我度过我的青春里最难忘的时光，感谢大学期间遇到的所有事，使我愈发坚强而平和。最应该感谢我的家人朋友，在这样一个紧张、彷徨的阶段，给予我关心、支持、包容和鼓励。如今，大家要各自奔赴不同的领域和城市，追求自己的理想，我祝福大家能有所收获，无怨无悔。参考文献【1】郑文杰，欧阳政.植物有机硒的化学及其医学作用[M]．东南大学出版社，2001，7～8．【2】ClarkLC,TumbullBW，TumbullBW．Effectsofsdeniumsupplementationforcancerpreventioninpatientswithcarcinomaoftheskin：arandomizedcontrolledtrial．JAMA，1996，276：1957～1963.【3】张颖,杨清清,宋毅,etal.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定富硒食品中无机硒和有机硒的含量[J].中国食品卫生杂志,2017(2).【4】仲娜.电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)及高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用技术(HPLC-ICP/MS)用于富硒生物样品中硒的化学形态组成及分布规律研究[D].中国海洋大学,2008.【5】李林富,张国宾.硒作为食品强化剂的意义和可能性[J].中国公共卫生,1991,7,(1).【6】顾公望,季毕澄.硒与癌症流行病学研究现状[J].国外医学：医学地理分册,1994(3):108-111.【7】卫好国.硒抗癌作用研究进展[J].中国冶金工业医学杂志,1990(1):24-26.【8】任煊静,赵淑敏,叶炜宗.硒与重金属相互作用的研究进展[J].广州化工,2014(17).【9】李小樑.微量元素与长寿[J].广东微量元素科学,2005(12):37-37.【10】赵秋香,盛献臻,李媛媛.离子对反相高效液相色谱分离几种常见的有机硒[J].广州化工,2011,39(14),112-114.【11】胡斌,江祖成.色谱-原子光谱/质谱联用技术及形态分析[M].2005：279.【12】李娜,王旭,孙芳芳.硒形态分析研究进展[J].湖北农业科学,2011(3):437-441.【13】王金荣,付佐龙,邢志.液相色谱-原子荧光光谱联用(HPLC-HG-AFS)技术对饲料及富硒酵母中硒形态的分析[J].饲料工业,2013,34(1).【14】IpolyiI,CornsW,StockwellP,etal.SpeciationofinorganicseleniumandselenoaminoacidsbyanHPLC-UV-HG-AFSsystem[J].JournalofAutomatedMeth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