《快速监测度洛西汀血药浓度的方法》征求意见稿

1T/CIXXXX—2023快速监测度洛西汀血药浓度的方法本文件提供了快速监测度洛西汀血药浓度的方法，该方法采用二维色谱仪系统，包括制备溶液、设置色谱参数、实施检测以及计算含量。本文件适用于快速监测度洛西汀血药浓度的方法。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4技术方案一种快速监测度洛西汀血药浓度的方法，采用二维液相色谱仪系统，二维液相色谱仪系统为PM3000系统，包括带在线脱气单元的双三元梯度泵、自动进样器、辅助泵、带有一个六通阀的柱温箱和检测器DAD。4.1制备溶液制备溶液的方法比较灵活，在这里不做限定。蛋白沉淀剂为硫酸锌溶液溶液和乙腈的混合物，其中硫酸锌纯度不低于98%，可市售获得。硫酸锌溶液的质量浓度为3%~5%,硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：（1~10）。4.1.1空白血浆溶液取正常人空白血浆2mL，加入蛋白沉淀剂稀释定容至10mL，混合后超声5min，将上述溶液转移至EP管中，于离心机中以10000rpm离心10min，取其上清液，经0.22µm的尼龙滤膜过滤，得到的滤液作为空白血浆溶液。4.1.2系统适用性溶液取盐酸度洛西汀对照品51.64mg（相当于度洛西汀46mg精密称定，加入甲醇溶解，定容至100mL，得到浓度为0.46mg/mL的度洛西汀储备液；精密量取度洛西汀储备液1mL至10mL的容量瓶中，用甲醇稀释定容，得到浓度为46μg/ml的度洛西汀标准溶液。取10μL46μg/ml的度洛西汀标准溶液于10mL的容量瓶中，加入空白血浆2mL，加入蛋白沉淀剂稀释定容至10mL，混合后超声5min，得到每1mL中含46ng的度洛西汀溶液，将上述溶液转移至EP管中，于离心机中以10000rpm离心10min，取其上清液，经0.22µm的尼龙滤膜过滤，得到的滤液作为系统适用性溶液。4.1.3标准曲线溶液将上述46μg/ml的度洛西汀标准溶液稀释500倍，得92ng/mL的线性储备液，采用倍比稀释法逐级稀释得到不同浓度的度洛西汀工作溶液，分别精密量取上述度洛西汀线性储备液各5mL至10mL、4mL至10mL、3mL至10mL、2mL至10mL、2.5mL至50mL容量瓶中，每个瓶中加入空白血浆2mL，加入蛋白沉淀剂稀释定容，混合后超声5min，将上述溶液分别转移至EP管中，于离心机中以10000rpm离心10min，取其上清液，经0.22µm的尼龙滤膜过滤，分别得到浓度为46ng/mL、36.8ng/mL、27.6ng/mL、18.4ng/mL、4.6ng/mL作为标准曲线溶液，按照上述46μg/ml的度洛西汀标准溶液的配制方法，另外配制一份27.6ng/mL的度洛西汀标准品溶液作为含量测定溶液，用来按照外标法计算样品中度洛西汀的浓度。2T/CIXXXX—20234.1.4供试品溶液取正在进行盐酸度洛西汀治疗的患者的人体血浆2mL至10mL的容量瓶中，加入蛋白沉淀剂混匀并稀释定容，混合后超声5min，将上述溶液转移至EP管中，于离心机中以10000rpm离心10min，取其上清液，经0.22µm的尼龙滤膜过滤，得到的滤液作为供试品溶液。4.2设置色谱参数在二维液相色谱仪系统系统上设置一维柱色谱条件的参数、二维柱色谱条件的参数和大体积进样条件的参数和阀切换条件的参数，并使用空白血浆溶液和系统适用性溶液确认，待二维液相色谱仪系统系统的压力和基线平衡稳定后，注入不少于5针空白血浆溶液和系统适用性溶液用来确认。实验用的二维液相色谱仪系统为PM3000系统，包括带在线脱气单元的双三元梯度泵、自动进样器、辅助泵、带有一个六通阀的柱温箱和检测器，上述双三元梯度泵包括一维泵和二维泵，一维泵用于在线固相萃取，二维泵用于色谱分析，吸附在一维柱的度洛西汀通过六通阀切换到分析流路中，可以将原来用4~5h进行固相萃取前处理的样品缩短至3min左右在线完成，净化和浓缩后的度洛西汀样品直接进行定量分析。上述六通阀设置的阀口位置顺序为阀1、阀2、阀3、阀4、阀5和阀6。如图1，一维柱色谱条件和二维柱色谱条件通过阀切换技术的系统配合的工作原理如下：a)一维洗脱液通过一维泵由阀2接口进入，阀2接口切换经阀1接口，经与阀1和阀4通过管线相连的一维柱实现待测物的富集浓缩，多余的一维洗脱液，由阀4接口切换经阀3接口至阀3接口经管线排出；b)富集的馏分待测物由阀4接口切换经阀5接口，二维洗脱液通过二维泵由阀6接口进入，阀6接口切换经阀1接口，使得一维柱以正向模式与二维柱串联，乙腈-0.05mmol磷酸二氢钾（PH=6.0）缓冲液作为洗脱液将馏分待测物从一维柱上洗脱下来，经管线由阀5接口进入二维柱进行进一步分离，分离的待测物经所述检测器检测后由管线排出，检测器通过信号传输转化在计算机上显示出相应的色谱图。在上述PM3000系统中的自动进样器的最大进样体积为1000μL，可以连续进样富集待测物质，通常对于一维HPLC而言进样体积过大会严重导致色谱峰扩展而影响分离度进而降低灵敏度，设计了通过大体积进样来提高本方法的灵敏度。大体积的样品先流经一维柱富集在柱顶端，然后再经过一维洗脱液洗脱血浆样品中的大分子蛋白成分和其他杂质，通过正向切阀流入到二维柱中进行分离和定量分析。由于样品溶剂中含有高比例的有机3T/CIXXXX—2023溶剂，所以用了大体积泵进水稀释，确保被测物质在一维柱上富集不流出，由于进样体积较大，容易导致色谱峰扩展及变形，采用一维柱富集纯化后洗脱液正方向切阀，进行洗脱后再流经至二维柱，并设计了辅助泵在一维柱富集纯化期间注入纯化水，使一维柱中的待测成分充分保留，这样就可实现大体积进样也不会使色谱峰峰型变宽。而且，辅助泵注入纯水的程序为：0-3min，流速为1.2mL/min；3-3.1min，流速由1.2mL/min改变为0.1mL/min；3.1-14.5min，流速为0.1mL/min；14.5-14.8min，流速由0.1mL/min改变为1.2mL/min；14.8-15.0min，流速为1.2mL/min。为了能够在短时间（3分钟内）纯化富集血浆中的有效成分，对一维柱的填充剂材料基质要求有很好的亲水性，因为血浆中含有血细胞和大分子的蛋白，这就需要色谱纯化分离有分子排阻和色谱分配两种模式同时存在，并结合度洛西汀与填充剂材料的相互作用，在本实施例中，具体的一维柱为NNJW16851Cat.No.12439MFPh-1S-5固相萃取柱，规格为4.0mml.D.×20mm，针对度洛西汀的化合物结构，对二维柱的填充剂材料基质的表面要求有很好的亲水性，二维柱的双封端技术优良，依据度洛西汀在二维柱中的热力学和动力学特点，使得度洛西汀具有较好的分离度，可以选择填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，具体的二维柱为Unisil3-120C18UltraQCS180425色谱柱，规格为SS4.6mm×100mm，其填料中硅醇基活性极低，该色谱柱具有优良的稳定性和耐用性，使用寿命达1000针次以上。进一步的，在二维液相色谱仪系统上设置的色谱参数应符合表1。表1色谱参数NNJW16851Cat.No.12439MFPh-1Unisil3-120C18UltraQCS二维流动相A：乙腈；二维流动相B：0.05mmol磷酸二氢钾，00NOTimeValvel123为了核实二维液相色谱仪系统具有良好的分离度和精确度，以胜任将要实施的检测工作，在进样空白血浆溶液后，重复进样系统适用性溶液并将所测结果与本文件中的要求进行比较，如果符合，后续的供试品检测分析则可以继续进行。在本实施例中，对系统适用性溶液的要求为空白血浆溶液的色谱图中不能有度洛西汀峰的干扰峰，系统适用性溶液中的度洛西汀色谱峰与其他物质色谱峰的分离度不小于1.5，度洛西汀峰纯度阈值不小于0.990，重复进样5针度洛西汀峰峰面积的相对标准偏差(RSD)应不得过1%。4.3实施检测4T/CIXXXX—20234.6ng/mL、18.4ng/mL、27.6ng/mL、36.8ng/mL、46.0ng/mL的标准曲线溶液和供试品溶液分别注入所述二维液相色谱仪，各进样1针，记录色谱图时间15分钟。4.4计算含量分析得到所有标准曲线溶液对应的度洛西汀的峰面积，将上述结果通过加权最小二乘法进行线性回归，得到度洛西汀的标准曲线；标准曲线的方程为y=ax+b，其中，y为标准曲线溶液对应的度洛西汀的峰面积，x为标准曲线溶液中度洛西汀的浓度，得到的线性方程为：y=0.063x-0.0099，线性相关系数r=0.9999。在上述的标准曲线线性范围内，按外标法计算得到供试品溶液中度洛西汀的含量。计算公式为：血浆样品中度洛西汀的浓度=供试品中度洛西汀的峰面积*度洛西汀标准品浓度*稀释倍数/度洛西汀标准品峰面积。考察了不同配比、不同浓度硫酸锌溶液的蛋白质沉淀剂对方法检测结果的影响：a)试验组1，0.3%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：3；b)试验组2，0.4%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：3；c)试验组3，0.5%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：3；d)试验组4，0.5%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：1；e)试验组5，0.5%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：3；f)试验组6，0.5%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：4；g)试验组7，0.5%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：6；h)试验组8，0.5%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：8；i)对比例1，0.2%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：3；j)对比例2，0.6%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：3；k)对比例3，0.5%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为2：1；l)对比例4，0.5%硫酸锌溶液与乙腈的体积比为1：11；m)对比例5，乙腈1000μL；考察回收率，结果应符合表2。表2不同配比的蛋白沉淀剂对方法回收率的影响由表2可知，试验组1～试验组8提供的蛋白沉淀剂可保证本发明的方法回收率在95%～105%之间，采用0.5%的硫酸锌溶液，与乙腈的体积比在1：4～1：6范围内时，可保证本发明的方法回收率在98%～102%之间。考察了超声时间对方法回收率的影响，超声时间不能少于3min，在超声的作用下，硫酸锌水溶液的溶剂化作用更有利于血浆中度洛西汀的提取，乙腈可以更好的辅助将蛋白沉淀下来，时间过短不利于度洛西汀的提取，导致方法回收率偏低，不准确，为了获得准确度更高和操作方便，选择超声时间5min。如图2-3所示，系统适用性测试实验，结果为空白血浆溶液的色谱图中没有出现度洛西汀干扰峰，系统适用性溶液的色谱图中与度洛西汀峰最近的杂质峰的分离度为2.0，大于1.5，符合本方法的要求，从而验证了本方法专属性强。5T/CIXXXX—2023如图4所示，灵敏度实验，结果为本方法的定量下限为2.3ng，表明本方法灵敏度高。6T/CIXXXX—2023如图5所示，线性范围实验，结果为本方法的线性范围为：4.6ng/mL-4