分子生物学学习资料：answer-ch11

11.2描述一个说明TFⅡD是第二类聚合酶的起始前复合体的基础成分的实验，并给出该实验的结果。答：Reinberg、Greenblatt以及他们的研究伙伴所做的通过分析蛋白缺失时的凝胶迁移率来检测各个蛋白的结合顺序的实验证明了TFⅡD是第二类聚合酶的起始前复合体的基础成分。该实验分两组进行，方法与结果具体如下：第一组：关于DABPolF复合体，研究者使用TFⅡD、A、B、F和RNA聚合酶二，以及包含腺病毒主晚期启动子的带标DNA做凝胶迁移率检测。第1道显示出的是由TFⅡD和TFⅡA组成的AD复合体；第2道加入了TFⅡB，显示出出现了新的复合体DAB；第3道又加入了TFⅡF，但是看起来与第二道差不多，这说明TFⅡF好像在聚合酶Ⅱ不存在的时候不会绑定上去；第4-7道中加入了越来越多的聚合酶Ⅱ，结果显示大聚合体DABPolF以及DBPolF开始出现并越来越多；第8-11道将TFⅡF量逐渐减少，结果显示大聚合体的数量也越来越少，直到第12号道TFⅡF的量减少至0，也就没有DABPolF和DBPolF出现了，这暗示TFⅡF行使着将聚合酶Ⅱ带到复合体上的功能；第13道只缺少TFⅡD，我们发现在TFⅡD不存在的情况下根本没有任何复合体产生；第14道只缺少TFⅡB，结果是只形成了DA复合体；第15道只缺少TFⅡA，结果是TFⅡA的不存在并不影响DBPolF的形成；第16到为对照，说明在所有的因子都存在的情况下可以形成所有的复合体。第二组：关于DBPolFEH复合体，研究者使用在包含腺病毒主晚期启动子的带标DNA上装配的DBPolF复合体（不含TFⅡA，第1道）为起始进行研究。然后他们依次加入TFⅡE和TFⅡE+H（第2、3道），结果显示每加入一个新因子，复合体就会变得更长，迁移率的减少就会更多。第4-7道再现了缺少各种因子的情况（如图上首行所标），最好的状况是形成了DB复合体（第4、5道），最差的状况是在缺少TFⅡD的情况下没有任何复合体形成。通过这两组实验我们可以看出，在缺少TFⅡD的情况下不会有任何复合体产生，也就是说TFⅡD是最先绑定在DNA上的，其他因子的绑定都取决于TFⅡD在TATAbox上的存在与否。也就证明了TFⅡD是第二类聚合酶的起始前复合体的基础成分。11.4TFIIF和RNA聚合酶II可以互相结合，但这两者都不能单独结合在前转录起始复合体上。找到一个可以证明以上结论的实验，描述实验条件并给出实验结果。答：下图是一个体现DABPolF复合体形成的实验的实验结果：Reinberg及其同事用TFIID，A，B，F和RNA聚合酶II，以及标记过的含腺病毒晚期启动子的DNA片段进行了凝胶移动性变化实验。结果的解释如下：第1泳道展示的是由TFIID和A组成的DA复合体。第2泳道展示的是在DA复合体基础上添加TFIIB后可以形成新的DAB复合体。第3泳道加入了TFIIF，但没有RNA聚合酶II，其结果与第2泳道基本一致，说明在无RNA聚合酶II的情况下，TFIIF无法与DAB复合体结合进一步形成新的复合体。第4至7泳道在含D，A，B，F的基础上又加入了浓度逐渐增加的RNA聚合酶II，可见，在加入RNA聚合酶II后，F可以与其结合形成PolF，后者可以进一步与DAB或DB结合形成新的复合体。第8至11的情况与第4至7道相似，不同的是浓度发生变化的是TFIIF。第12泳道与第3泳道相似，在无TFIIF的情况下，RNA聚合酶II无法与DAB进一步结合形成新的复合体。第13泳道说明在D不存在的情况下，无法形成任何复合体，也就是说TFIID是形成前转录起始复合体的关键因素。综合上面的结果，我们发现如果TFIIF和RNA聚合酶II结合到前起始转录复合体的必要条件是TFIIF和RNA聚合酶II均存在，二者结合后才能进一步与DAB结合。二者中单独的一方均无法与DAB结合。11.5说出分别由DAB和DABPolF复合体得到的印迹法结果的不同之处。根据这个不同，说说你能得到的结论。答：图11.5A即为DAB和DABPolF复合体做印迹法得到的结果。两个结果的不同之处在于，DABPolF复合体保护的范围比DAB复合体保护的范围大了很多，有一个很长的空白断带。从图中推断，TFⅡD，A和B保护了TATAbox区域（在-17到-42位）。但是RNA聚合酶Ⅱ，TFⅡF两者扩大了这个保护的范围，在非模板链上大约达到了34碱基，即从-17到+17位。图11.5B说明了其中一种解释的方式。在DAB复合体的基础上，RNA聚合酶Ⅱ与TFⅡF因子相互作用，可能形成一个二元的复合体。从而扩大了保护的区域。图11.511.6描述一个能够体现TATAbox中的突变能对TATAbox结合蛋白(TBP)结合产生影响的实验，并给出这个实验的结果。答：实验名称重组人类TATAbox结合蛋白与野生型和突变型TATAbox结合比较实验步骤(a)与野生型TATAbox结合1.实验前分别在牛痘病毒和细菌中克隆人类TATAbox结合蛋白vhTBP和bhTBP。2.使这两种蛋白分别与呼吸系统病毒后期启动子结合，每种蛋白的加样量逐步增大。3.用印迹法来测定结合效率。每种蛋白的加样量按照谱图顶部的楔形符号逐步增大。(b)与突变型TATAbox结合使用含有突变型TATAbox（野生型的序列TATAAAA突变成TTATCAT）的DNA来做与（a）相同的测试。(c)使野生型TATAbox与克隆人类TATAbox结合蛋白的C末端180个保守的氨基酸组成的片段结合，做相同的测试。实验结果(a)两种重组人类TATAbox结合蛋白在TATAbox上留下了相同的印迹，对照组中含有相同数量的大肠杆菌提取物，但是没有加入重组人类TATAbox结合蛋白。(b)几乎没有任何印迹出现。(c)克隆人类TATAbox结合蛋白的C末端180个保守的氨基酸组成的片段能够留下与完整的TATAbox结合蛋白下同的印迹。在大致相同的浓度条件下，两种克隆人类TATAbox结合蛋白以及TATAbox结合蛋白的C末端180个保守的氨基酸组成的片段等能保护呼吸系统病毒后期启动子上TATAbox周围相同的20bp的区域，唯独不能结合本实验中被突变的TATAbox(TATAAAA突变成TTATCAT)。实验结论1.TATAbox中的某些突变将会影响其与TBP的结合，减弱它们之间的相互作用。2.TATAbox结合蛋白的C末端180个保守的氨基酸组成的片段是与TATAbox结合的结合区域。11.8描述一个能够体现TFIID对转录因子Sp1有反应而对TBP却没有反应的实验，并给出这个实验的结果。答：实验名称TBP相关因子在TFIID对Sp1的反应中的作用实验步骤实验中使用的测试启动子是以一个复合的启动子，含有Sp1相应元件——来自SV40早期启动子的6个GCbox（红色标识）以及TATAbox（蓝色标识）和来自呼吸系统病毒晚期启动子的转录起始子（转录起始位点）。从这个复合启动子开始的精确的起始在（b）中所述的run-offassay中将产生一个350nt长度的转录产物。进行体外转录测试。分别将TFIID、bhTBP、vhTBP与TFIIA,TFIIB,TFIIE,TFIIF，RNA聚合酶II混合，然后进行run-offtranscriptionassay，标记物是[α-32P]UTP。实验结果泳道1和2说明完整的TFIID在这个启动子上介导了高水平的转录，并且Sp1大大增强了转录水平。泳道3–6说明在缺少TAFIIs的条件下，仅有TBP介导的转录对Sp1没有响应。实验结论单一的TBP无法对Sp1产生响应,而完整的TFIID则表现处高水平的响应。TBP相关因子在TFIID对Sp1的反应中具有重要作用。11.9在TATAbox中用dC取代dT,dI取代dA（构成一个CICIbox）对于TFIID的结合没有影响。提出一个能说明这个事实的假说。答：假说：TFIID中的TATAbox结合蛋白与TATAbox的小环结合。已知在DNA的小环中，次黄嘌呤核苷中的次黄嘌呤碱基貌似腺嘌呤，但在DNA的大环中两者相去甚远；类似的情况是，在DNA的小环中，胞嘧啶貌似胸腺嘧啶，但在DNA的大环中两者相去甚远。所以，在TATAbox中用dC全部取代dT,dI全部取代dA（构成一个CICIbox）相当于DNA的小环几乎没有受到影响，而DNA的大环则被全部改变。这一改造过的DNA可用于定位TBP与TATAbox的作用位点。Starr和Hawley的实验结果支持这一假说。他们构建了CICIbox用于测试。实验结果是CICIbox的作用与TATAbox相当，而一个无关的DNA没有与TFIID结合。11.10TBP具有怎样的外形？TBP于TATAbox的相互作用中它们的空间相互关系是怎样的？答：TBP本身看上去像是一个有两个马镫的马鞍（如上图所示）。上图显示以橄榄色来标示了TBP的骨架。“马鞍”长轴在平面内。在TBP以下的DNA用了多种颜色来表示。其中和蛋白质存在相互作用的部分用橙色标识（碱基对用了红色来标识），而与蛋白质不存在相互作用的部分用了蓝色标识（碱基对用了灰色来标识）。蛋白质打开了DNA的小环并几乎拉直了双螺旋弯曲的部分。TBP的两个“马鞍”均插进了DNA的小环中。图中DNA的左末端伸出纸平面约25度，而右末端插入纸平面约25度。整个DNA在TBP的作用下弯曲了约80度。图11.10TBP-TATA复合物结构11.11描述实验证明TBP对于三种启动子的转录是必需的，并给出实验结果。答：TBP不仅仅是在有TATAbox的第二类启动子中起作用，同时，它也在没有TATAbox的第二类启动子中起作用。当然，实验证明，它也在没有TATAbox的第三类启动子和第一类启动子中发挥作用。用别的话来说，就是TBP是真核生物中，操纵各种启动子所通用的因子。不论这个启动子是否有TATAbox，甚至没有可识别它们的聚合酶，TBP照样可以操纵。图11.11中的实验结果可以表明。在第1和第2泳道中，我们都可以看到TBP发挥了作用，使得转录成功。11.13描述实验鉴定TAFs能够结合到含有TATAbox、转录起始子核下游调控元件的II类启动子上，并给出实验结果。答：第1泳道中可以看出两种TAFIIs(TAFII250和TAFII150)结合到了Hsp70promoter上，因此被标签上了。但是第2泳道中的TFIID被撤去以后，没有蛋白质可被标记。再结合第3第4泳道，我们可以得出结论就是，蛋白质的翻译需要有TAFII250andTAFII150结合到promoter上。而且，这个promoter必须含有aTATAbox,aninitiator,andadownstreamelement。图11.1311.14描述实验比较TBP和TBP–TAFII250–TAFII150的DNasefootprinting结果，并给出实验结果。答：图11.14中说明的是仔细检验三重复合体TBP–TAFII250–TAFII150的DNasefootprinting实验。图中说明TBP在TATAbox中引起了标记，然而此三重复合体在theinitiator和downstreamelement处又增加了一个标记。这就说明另两个TAFIIs是结合到了theinitiator和downstreamelement上去了。图11.14TBP和TBP–TAFII250–TAFII150的DNasefootprinting结果11.15图示在不含TATAbox的II类启动子中TBP与启动子的结合模型。答：对于没有TATAbox的promoter来说，有两种情况。一种是有initiator和downstream的，另一种是含有GCbox的。此时，TATAbox不再做为bindingsite，因此TBP也就不再做为结合因子。对于有initiator的来说，结合因子是TAFⅡ150，和TAFⅡ250，这两个因子与initiator结合，从而使TBP也结合上去。同时其他的因子也结合上去形成完整的复合体。而GCbox中，结合因子是SP1。而TAFⅡ150TAFⅡ250TAFⅡ110帮助TBP结合上去。同时其他的因子也结合上去形成完整的复合体。TATAbox广泛存在，在三种RNAPolymerase（不管有没有TATAbox）中都有，虽然它不作为bindingsite（在TATA-lesspromoter中）但是它还是在真个复合体中起到很大的作用的。它们的具体结合方式如下图：11.16描述并给出实验结果，以说明由含有GCboxes的第二类增强子影响的转录激活依赖于Sp1和TAFII110。答：1）发表于Cell84：1629，1996年的由Tjian及其同事所做的实验可以说明Sp1对转录活性的作用。a.测试的增强子的结构见图11.16A：含有6个GCboxes。b.实验结果的示意图如图11.16B：转录产物大小为375nt分别将TFIID、bhTBP、vhTBP(在图中顶端标出)与TFIIA，TFIIB，TFIIE，TFIIF和第二类RNA聚合酶混合，+、–号表明是否含有Sp1。由此构成的6组中明显第2组表达了大量的转录产物，说明Sp1的参与对转录激活有决定性作用，另一方面，TFIID除了含有TBP以外还含有TAFIIs，说明TAFIIs的参与也有重要作用。图11.162）发表于Cell79p.96,f.3b-c的由Tjian及其同事所做的实验可以说明Sp1和TAFII110共同起着重要作用。a)用于测试的序列包含一个TATAbox和3个位于上游的GCboxesb）实验结果示意图如图11.16C：该实验将果蝇细胞中的TFIID去除，分别用（TAFII250、TAFII150、TBP），（TAFII250、TAFII150、TAFII110、TBP）的混合物代替（在图中下部标出）图中顶部-、+、++分别表示Sp1含量：无、少量、大量；由实验结果可以看出：无Sp1则转录产物基本检测不到；无TAFII110则转录表达量较低；当Sp1和TAFII110同时存在时检测到大量转录产物，说明转录被激活；综上，说明Sp1和TAFII110在转录激活中共同起着决定性作用。11.17全基因组表达分析指出，酵母的TAFII145只在16%的基因的转录中起作用，而TAFII17在67%的基因转录中起作用。试分析一下其中的原因。答：随着研究的逐渐深入，会发现越来越多的例外，例如在本例中，首先并不是所有的基因的转录都需要转录因子的作用；其次作为转录因子的一种，虽然TFIID的作用是处于核心的地位，但可能并不是所有的POLII型基因的转录所必需的，其功能只是在POLII的本底转录得基础上继续予以加强；其次TAFII145可能虽然是TAFII的重要成份，但是否重要到必需的程度也未可知，而且是否会被其他机制所代替也不一定，综合以上各种不确定因素来看，一个转录相关蛋白的某一个成分相对于全基因组的基因的必须度16%左右是可以理解的；关于TAFII1767%的必须度则只是这一因子在转录中的重要性的一种体现。举例描述下列情况下的II类转录前起始复合体。11.18举例描述下列情况下的II类转录前起始复合体：a.AnalternativeTBP；b.AmissingTAFII；c.NoTBPorTBP-likeprotein。答：1）AnalternativeTBP上图11.11展示的是TBP发生突变后，对三种RNA聚合酶转录作用的影响。研究者准备了野生型和两种不同的温度敏感性（在TBP有损伤）细胞提取物，在24℃下生长，然后在37℃生长1小时，然后保持在一个较低的温度下。接着，加入含有可以被三种RNA聚合酶识别的启动子的DNA，并用S1法进行转录分析。上图就是所得结果。热冲击对于野生型没有影响（lanes1和2）。但是无论是否进行热冲击，I143→N的突变体几乎都不能支持任何一种RNA聚合酶的转录（lanes3和4）。显然，TBP的突变影响了三种RNA聚合酶的转录。另一种突变体P65→S，虽然无论热冲击与否，都几乎不能支持聚合酶II和III的转录，但是如果没有热冲击，它可以允许聚合酶I在野生型水平的转录，而热冲击减小了聚合酶I的转录水平大约一半。最后，野生型的TBP可以修复三种聚合酶在突变体中的转录。2）AmissingTAFII上图11.18展示的是在只有TBP，没有TAFII时对于Sp1的应答。TAFII有许多功能，其中两个主要的功能是与核心启动子元件的相互作用，以及与特异基因转录因子的相互作用。不同的转录激活子（transcriptionactivators）需要不同的TAFII组合来提高转录水平。TFIID可以参与被Sp1因子激活的反应，但是TBP不行。上图11.18说明了Sp1可以在TFIID存在时刺激转录，但是在只有TBP存在时不能刺激转录。Lanes1和2说明自然的TFIID可以支持高水平的转录，而这种转录又可以被Sp1转录因子显著提高。Lanes3到6证明了在缺乏TAFIIs时，任何重组的人类TBP的转录都不能被Sp1因子刺激。3）NoTBPorTBP-likeproteinTBP并不是完全普遍的被需要的。高等真核生物中的一些启动子可以对另一种蛋白质TRF1发生应答。一些启动子可以被TFTC刺激，而不是被TFIID。上图11.21是Drosophilatudor控制区。这个基因有2个启动子，两个启动子间距大约77bp。下游启动子有一个TATA框，可以与含TBP的前起始复合体结合。而上游的启动子有一个TC框，可以与含TRF1的前起始复合体结合。在上游启动子激活的情况下，下游启动子则处于抑制状态，此时TBP不参与上游启动子的调控作用。11.19在转录过程中，TFⅡA和TFⅡB因子扮演什么样的角色？答：TFⅡA：TFⅡA含有二个亚基（酵母中），或三个亚基（果蝇和人）。TFⅡA与TFⅡD结合，并增强TFⅡD与TATA框的结合，稳定TFⅡD-DNA复合体。在体外转录研究中，在TFⅡD得到纯化后，就不再需求TFⅡA了。在完整的细胞中，TFⅡA似乎能抵消抑制因子诸如与TFⅡD相关的DR1和DR2的作用，很可能是TFⅡA与TFⅡD结合结果阻碍了这些抑制因子的结合，让组装过程得以继续。TFⅡB：TFⅡB是作为连接TFⅡD和TFⅡF/聚合酶Ⅱ的桥梁。它含有二个作用域，一个与TFⅡD结合，另一个与TFⅡD和TFⅡF/聚合酶Ⅱ结合，来继续完成转录起始复合体的组装。下图是一个TFⅡA-TFⅡB-TBP-TATA框复合体的假想结构，这一结构显示TFⅡA和TFⅡB分别与TBP上游的下游马镫结构相结合。这就将这两个因子放在有利的位置上来执行它们的功能。HEHE图11.19TFⅡA-TFⅡB-TBP-TATA框复合体结构示意图。11.20图示TBP-TFIIA-TFIIB三聚体与DNA结合后的大概结构轮廓，并指出这些蛋白的相对位置，这一结构与三者的作用有什么联系。答：图11.20TBP-TFIIA-TFIIB三聚体结构示意图。如图11.20为TBP-TFIIA-TFIIB三聚体的草图。图中，灰色的为DNA；深蓝和浅蓝区域分别为TBP的下游部分和上游部分；粉色和红色区域分别为TFIIB的羧基末端域和氨基末端域；绿色和黄色区域分别为TFIIA的核心大亚基和小亚基（此处的TFIIA是酵母中的，含有两个亚基）。TFIIB与TBP的下游部分（羧基马镫型末端）结合，TFIIA与TBP的上游部分（氨基马镫型末端）结合TFIIA的主要功能可能是稳定TFIID与启动子的结合，而图中TFIIA在上游的定位恰好使它可以稳定TBP与TATAbox的结合，同时，也可能跟与上游元素结合的转录激活因子发生作用。TFIIB的功能是连接TFIID与TFIIF/RNA聚合酶II。而TFIIB在下游的定位使它可以与TFIIF/RNA聚合酶II发生作用，把聚合酶定位在转录起始位点（图11.20中的+1位置）。11.21描述实验证明TFIIH，而不是其它的通用转录因子，使RNA聚合酶II由IIA形式转变为IIO形式，并说明在这一过程中其它转录因子是如何帮助进行的。答：如下图所示：(a)在RNA聚合酶PolII中加入各种不同转录因子的混合物(如图顶部所示)。然后在所有反应中加入[γ-P32]标记的ATP对聚合酶进行磷酸化。再对蛋白进行电泳与放射自显影，观察结果：lane4说明TFIID,B,F和E并不能使聚合酶磷酸化。Lane5-10则说明了仅仅是TFIIH便能使部分聚合酶磷酸化，而其它转录因子更促使了这一反应。尤其是TFIIE，对聚合酶的磷酸化有很强的促进作用，从(b)可见。(b)在TFIID,B,和H存在的情况下，加入或不加E，进行同(a)一样的磷酸化处理过程，在不同的时间段对产物进行分析。可见在E存在的情况下，RNA聚合酶磷酸化的速度比起无E时要快得多。11.22描述实验说明TFIIH使聚合酶II的CTD去磷酸化，并给出实验结果。答：Figure10.17中，IIa,IIb和IIo是RNA聚合酶II最大亚基的三种不同形式（表现在CTD一端的不同），分别对应于三种RNA聚合酶IIA,IIB和IIO.如图11.30所示：(a)在TFIID,B,F，E和H存在时，分别加入聚合酶IIA,IIB和IIO，用[γ-P32]标记的ATP对其进行磷酸化。电泳，放射自显影后，得到以上结果。IIB缺少CTD一段，没有被磷酸化。IIA和IIO相比，IIA更好地被磷酸化，这正如从Figure10.17中预料的一样。(b)用蛋白酶chymotrypsin将CTD从已磷酸化的聚合酶亚基IIa上分解出来，进行电泳，通过放射自显影观察结果。Lane1是酶解前的反应产物，lane2，3是酶解后的产物，带在CTD的位置上，表明CTD确实被磷酸化了。11.23描述DNA解旋酶活性检测实验，并说明如何用于描述TFIIH的解旋酶活性。答：如Figure11.31所示：(a)底物是由一段已标记的41个核苷酸组成的DNA片断，和与之有一段互补序列的一条长得多且无标记的DNA片断。加入或不加DNA解旋酶，将产物进行电泳。可知加解旋酶的带会在41nt处，而不加酶的带在>7000nt处。(b)用同样的底物，加入RAD25处理。lane1是热变性的底物；lane2是未加蛋白的对照；lane3是20ngRAD25，无ATP；lane4是10ngRAD25，加ATP；lane5是20ngRAD25，加ATP（RAD25是TFIIH的一部分）。从电泳结果可看出，RAD25可将DNA双链解开，则证明了TFIIH具有解旋酶的作用。11.24描述G-lesscassette转录实验，并证明TFIIH的DNA解旋酶活性在体外转录过程中是必需的。答：用野生型（RAD25）和温敏突变型（rad25-ts24）细胞的提取物，在突变型rad25-ts24能和不能保持活性的温度下，分别对一段G-lesscassette模板进行转录（只有ATP、CTP和UTP，无GTP，且有一个32P标记的核苷酸存在的情况下）。对转录产物进行电泳和放射自显影，得到的结果如下：(a)为rad25-ts24有活性的温度，(b)为rad25-ts24无活性的温度。可见，转录产物的有无与rad25-ts24活性的有无有关。说明了RAD25的DNA解旋酶性质对转录是必须的。11.25描述实验证明IIS可以引起RNA聚合酶II的转录延伸功能，并给出实验结果。答：如图11.34所示：根据时间轴，在特定的时刻加入相对应的物质：-3min加入DNA和RNA聚合酶；0min时加入4种NTP（其中GTP用P32标记），开始反应；+1min时加入肝素去结合游离的RNA聚合酶，这样所有的转录复合体都是处于延伸阶段。最后，在+2.5min时加入IIS(红色)或缓冲液(蓝色)作为对照。在不同的时间里抽出样本，对其放射性进行检测。比较两直线，可看出IIS对RNA链的延伸有促进作用。11.26描述一个能够说明ⅡS引起RNA聚合酶Ⅱ校正的实验，并给出实验结果。答：如右图11.26A所示：首先，分离未被标记的延长染色体组，这些染色体组被停滞在了启动子附近的多种位点上；然后，在放射性UTP存在的条件下标记染色体组中的RNA；接着，加入ATP或者GTP使RNA延长一个碱基至+43处。此处要求的碱基为A，但若只可提供G，即使低效，聚合酶也会错误的与G结合。事实上，超纯的GTP含有少量的ATP，因此，尽管只加入了GTP，AMP和GMP也被等量的结合在了+43处。下一步，可用RNaseT1在G后面截断产物，或者继续连接四种核苷酸，以使标记的RNA延至全长，再用RNaseT1剪切；最后，将所有RNaseT1产物进行电泳处理，用放射自显影法呈现出标记的产物。简单的用RNaseT1截断转录，就可以测量AMP和GMP在+43处的相对结合量，因为电泳明显的分离了7聚体末端的A和G。右侧图11.26B的第一道显示了一组没有核苷酸后缀的实验结果。末端为G的7聚体，错误结合G的结果，和末端为A的7聚体、以及末端为AC的8聚体几乎相当。第二道和第三道，分别显示了在ⅡS缺失或存在的情况下，核苷酸后缀的影响。有核苷酸后缀的、全长转录产物被RNaseT1截断，产生了一个以Gp结尾仍含有错误结合的G的7聚体，或者一个以Gp结尾的10聚体，并且在10聚体中，错误结合的G已经被校正为A。如果在ⅡS缺失的情况下后缀核苷酸，大量的错误结合的G会留在RNA中（见第二道中7聚体UCCUUCGp箭头指向的带）。但是，大多数产物出现在10聚体处（箭头标记UVVUUVAVAGp），暗示了多聚体可以在没有ⅡS的情况下作一部分校正。另一方面，在ⅡS存在的条件下后缀核苷酸，7聚体就会消失，所有的标记产物都会形成10聚体。因此说，ⅡS可以刺激转录的校正。图11.26ⅡS可以引起RNA聚合酶Ⅱ的校正功能11.27RNA聚合酶全酶有什么作用？全酶与核心酶之间有什么不同？答：RNA聚合酶=2\*ROMANII全酶包含有RNA聚合酶=2\*ROMANII和一个由转录因子及其他蛋白质构成的亚基。RNA聚合酶=2\*ROMANII全酶比核心聚合酶=2\*ROMANII多了转录因子及一些蛋白质或多肽。11.28描述一个通过印迹法实验证明SL1是一个种特异性的转录因子,并给出实验结果.答:如果我们提供小鼠的无细胞抽提物和两端模板DNA链，其中一条带有人类的rRNA启动子，另外一条带有小鼠的rRNA启动子。在正常转录的情况下，小鼠和人类的模板链可以分别转录出2400、1500核苷酸长度，如图11.28所示。图中第一道没有加人类的SL1转录因子，因此基本上只有小鼠的模板链进行了转录，随着人类SL1因子的加入（图中2~5道），人类的模板链转录的越来越多，而小鼠的模板链转录就相对的越来越少。（第5道可能由于加入量过多，导致两种DNA链的转录都被抑制）由此即可得，人类的SL1对人类的模板链可以进行特异性的转录，对小鼠的模板链的转录则影响不是很大，所以可以知道，SL1转录因子是一个种特异性的转录因子。图11.28SL1特异性实验11.31描述并给出用以说明“SL1中包含TBP”的共纯化及免疫沉淀反应实验的结果。答：1)共纯化实验Tjian和他的同事们以海拉细胞为材料做了人类SL1蛋白质分离纯化实验（部分如下图）：=1\*GB3①通过一系列步骤，逐步对海拉细胞内人类SL1蛋白质进行提纯；=2\*GB3②每一步提纯后，对所得的提取物进行SL1蛋白质的活度检测，即测定SL1蛋白质的含量；=3\*GB3③并且相应地对各个提取物做TBP的活度检测，即测定TBP的含量；=4\*GB3④最后分别比较每个阶段的提取物的SL1蛋白质和TBP蛋白的活度，结果显示，对于实验过程中先后得到的一系列提取物，SL1蛋白质和TBP蛋白的活度基本都在同一个提取阶段达到最大，即SL1蛋白质和TBP蛋白可以共纯化。并且蛋白凝胶电泳可以发现SL1蛋白质的分子量较TBP蛋白的大。这样的实验结果，让我们得出这样的推断：TBP蛋白是SL1蛋白质的一部分。2)免疫沉淀反应实验Tjian和他的同事们还以细胞核提取物(NXT)作为材料进行了免疫沉淀反应实验：=1\*GB3①对未经处理的细胞核提取物(NXT)进行S1分析，以测定其对人类rRNA基因的转录促进能力大小（Lane1andLane2）；=2\*GB3②往细胞核提取物中加入抗TBP蛋白的抗体(aTBP)，然后离心沉淀后取其上层清液，再对所得上层清液进行S1分析，以测定其对人类rRNA基因的转录促进能力大小（Lane3andLane4），发现转录能力基本没有了，说明TBP是rRNA基因转录所不可缺少的成分；=3\*GB3③往=2\*GB3②中所得的上层清液中加入4ng和12ng的SL1蛋白后，再次进行上述的S1分析（Lane5andLane6），发现转录水平恢复，并且转录能力随所加入的SL1蛋白增多而提高，说明SL1蛋白中是包含有TBP成分的。11.32描述用以鉴定SL1中的TAFs的实验，并给出实验的结果。答：操作如31题中免疫沉淀反应，在第二步中我们加入抗TBP蛋白的抗体(aTBP)，分别得到上层清液和沉淀。可以发现所得到的上层清液将失去原细胞核提取物所具有的rRNA基因转录能力，但是仅仅加入纯的TBP蛋白，并不能使其恢复转录能力。说明加入抗TBP蛋白的抗体(aTBP)后，还有其他一些与TBP蛋白的成分也一起沉淀掉了。即SL1蛋白中除了TBP，还是有其他成分的。图11.32沉淀的SDS结果图对沉淀进行SDS（如上图），结果发现，除了TBP蛋白和抗TBP蛋白的抗体，还有其他三种肽链，分子量分别是110，63，48KD。由于这几条肽链都与TBP蛋白紧密结合在一起，所以称其为TBPassociatedfactors（TAFs）。再根据其相对分子量的大小，分别命名为TAFI110,TAFI63,和TAFI48。进一步的实验表明，当我们在合适条件下，重新将TBP蛋白与三种肽链TAFI110,TAFI63,和TAFI48混合在一起后，发现确实可以得到具有所有SL1蛋白功能的产物。这更进一步地表明SL1蛋白确实由TBP蛋白以及TAFI110,TAFI63,和TAFI48组成。11.33我们如何知道TF=3\*ROMANIIIA对于5SrRNA基因的转录是必要的，但对于tRNA基因的转录却没有必要？答：Brown和他的同事们准备了三份卵母细胞的提取物和三份体细胞的提取物，两种提取物的第一份中不加其他蛋白，第二份中均加入一种不相关的抗体，一、二均作为对照，而在第三份中加入抗TFIIIA的抗体。然后在每一份提取物（共6份）中均加入克隆得到的5SrRNA基因和tRNA基因，并且都提供给带有标记的四种核糖核苷酸作为转录的原料。当转录已充分进行后，提取出6份产物中的RNA，并对其进行电泳，结果如右图所示：结果表明：当TFIIIA被抗体结合沉淀掉后（lane3a和lane3b），5S