单底物酶促反应

第一节动力学方程推导酶反响的根本动力学关系，是指酶反响速度与酶和底物间的动力学关系。由于酶和底物是构成酶反响系统最根本的因素，它们打算酶反响的根本性质、酶反响的速度规律，而其他各种因素也正是通过它们产生影响的；而且，这种动力学关系是整个酶反响动力学的根底。描写这种根本动力学关系的是米氏方程(Michaelis-Mentenequation)。v=vmax[S]/(Km+[S])酶促反响速度的测定与酶的活力单位1、测定酶促反响的速度必需测初速度2、酶活力3、酶活力的表示方法4、酶活力测定方法：终点法动力学法检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”〔质量、体积、浓度〕来表示，而常用酶催化某一特定反响的力量来表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化肯定化学反响的力量称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反响的速度来确定。酶活力测定方法终点法:酶反响进展到肯定时间后终止其反响，再用化学或物理方法测定产物或反响物量的变化。动力学法:连续测定反响过程中产物\底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反响的初速度。

酶活力的表示方法活力单位〔activeunit〕习惯单位〔U〕:底物(或产物)变化量/单位时间国际单位〔IU〕:1μmoL变化量/分钟Katal〔Kat〕：1moL变化量/秒比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小转换系数〔Kcat〕底物〔μmoL〕/秒·每个酶分子量度酶纯度比活力〔specificactivity〕量度转换效率各种因素对酶反响速度的影响2、底物浓度3、pH〔最适pH的概念〕4、温度〔最适温度的概念〕5、激活剂6、抑制剂1、酶浓度当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=k[E]底物浓度对酶反响速度的影响酶反响速度与底物浓度的关系曲线〔Michaelis—Menten曲线〕米氏方程的提出及推导米氏常数的意义米氏常数的测定单分子酶促反响的米氏方程及Km推导原则：从酶被底物饱和的现象动身，依据“稳态平衡”假说的设想进展推导。米氏方程:米氏常数:酶反响速度与底物浓度的关系曲线米氏方程的推导令：将〔4〕代入〔3〕，则：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：则：(1)经整理得：由于酶促反应速度由[ES]决定，即，所以(2)将（2）代入（1）得：(3)当酶反应体系处于恒态时：当[Et]=[ES]时，(4)所以

其次节米氏方程的争论一、米氏方程的特性二、米氏方程中v和[S]的关系当v＝Vmax时，v与[S]无关，只和[E0]成正比，这时说明酶的活性局部已全部被底物占据。当v＝0.5Vmax时，表示活性部位有一半被占据。当一个酶的Km，则任何底物浓度下酶活性部位被占据的分数：Ys=vVmax=[S]Km+[S]称为该酶促反响的相对速度。米氏方程所作曲线的曲度，不随Km和Vmax的变化而变化。所以任何酶只要听从米氏方程。则到达任何两个Vmax分数的对应底物浓度之比为一常数。例如：∴[S]0.9=9Km，同理[S]0.1=1/9Km，所以：[S]0.9/[S]0.1＝9Km/1/9Km＝81，即达90％Vmax与达10％Vmax所需底物浓度之比总是81。同样也可得到达70％Vmax与达10％Vmax所需底物浓度之比总是21。在酶促反响初速度区即在一级速度区，由于[S]<<Km，∴v=Vmax[S]/Km=k[S]。从这个方程可知，一级速度常数k=Vmax/Km。0.9VmaxVmax=[S]0.9Km+[S]0.9k的物理意义：底物在单位时间转变成产物的量。例如k=0.02min-1，就意味着底物在一分钟内会有2％转变成产物；假设k＝2.3min-1＝0.0383sec-1，那就意味着每秒钟有3.83％的底物变成产物。要测定任一时间范围内底物的消耗量或产物的生成量，可用一级速度方程积分。得：lg[S]=-kt/2.3+lg[St]第三节试验数据的处理

—分析酶促反响速度的作图法一、Lineweaver-Burk法(双倒数作图法)将试验所得的一些初速度数据v和[S]取倒数，得各种1/v和1/[S]，将1/v对1/[S]作图，得始终线。该直线纵截距＝1/Vmax，斜率＝Km/Vmax，横截距＝-1/Km。应用双倒数作图法处理试验数据求Km和Vmax等动力学常数比较便利，也是最广泛应用的一种方法，但欲要获得较准确的结果，试验时必需留意底物浓度范围，一般所选底物浓度需在Km四周。1.以下图是依据[S]在0.33～2.0Km范围时的试验结果而作的双倒数图，从今图可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。[S]在0.33～2.0Km的范围的试验结果而作出的双倒数图。2.假设所选底物浓度比Km大得多，则所得双倒数图的直线根本上是水平的。这种状况虽可测得1/Vmax，但由于直线斜率近乎零，-1/Km则难以测得。[S]在3.3～20Km的范围的试验结果而作出的双倒数图。3.假设[S]比Km小得多，则所作双倒数图的直线与两轴的交点都接近原点，使-1/Km和1/Vmax，都难以测准。[S]在0.033～0.2Km的范围的试验结果而作出的双倒数图。二、其它线性作图法1.Hanes-Woolf作图法即把米氏方程重排成线性方程2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法将米氏方程重排为线性方程：3.Eadie-Scatchard作图法将米氏方程重排为线性方程以上三种作图法也应留意选择底物浓度，不要使[S]比Km高得多或低得多。上述几种线性作图法各有其优缺点。双倒数作图法应用最广泛。但此法有两个缺点：第一，在v～[S]图上，由相等增值而给出的等距离各点，在双倒数图上变成非等距离的点，且多数点集中在1/v轴四周，而远离1/v轴的地方只有少数几个点，恰好这些点又正是主观目测以确定直线最权重的那些点。其次，在测定v时产生的小误差，当取倒数时会放大。在低底物浓度下更为敏感，因在高1/[S]值所得的一两个不准确的点，会给图的斜率带来显著误差。第一个缺点可通过选择适当的[S]，使1/[S]为等距离增值而得到抑制。对其次个缺点关键要留意在低底物浓度下使所测初速度误差尽可能减小。[S]/v对[S]作图，[S]未取倒数。另两个线性作图法，v未取倒数。前者对等距离[S]增值所测数据作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下测定误差较大时使用，比其它方法更牢靠。三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法这是依据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该法是把[S]值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在纵轴上，然后把相应的v和[S]连成直线，这样所得的一簇直线交于一点，该交点坐标为Km和Vmax。四、米氏方程的积分形式及其对数据的处理米氏方程是一个微分方程，其v=d[P]/dt或v=-d[S]/dt。依据从米氏方程重排得到的线性方程作图求Km和Vmax时，在试验过程中所取数据必需限于初速度阶段，即只能是小于5％的[St]转变为[P]的阶段。但有些状况，例如，产物浓度过低难以测定；或产物根本不能直接测定，而必需测定底物浓度的降低来反映产物的量(即[P]＝[St]-[S])。假设只限于5％的底物发生反响就难以测准其降低的量。在这些状况下，如用积分速度方程处理，就不受这种限制。例如，在10％～90％的[St]转变为[P]的数据均可使用。由于积分方程在反响全过程中都是准确的。最简洁的积分方程是在假定无产物抑制(即Kms<<Kmp)，并且Keq很大的状况下导出:重排成各种线性形式，如可直接测得Vmax/Km和Vmax，从而可算出Km，这样的处理方法，可从比Km大几倍的[St](如[St]＝10Km)开头，将反响进展到[S]显著低于Km(如[S]=0.1Km)止。五、Lee和Wilson改进双倒数方程对数据的处理改进的双倒数方程形式与双倒数方程相像，为其中是t这一段时间内的平均速度；为反响过程中底物浓度的算术平均值。由于积分方程对任何反响程度的数据处理都是准确的处理试验数据的准确性如何，用可以通过与比照：从以上计算可以看出，用改进的双倒数方程作图法处理试验数据时，即使反响已进展到30％，所引入的误差也不过1％左右。很明显，假设全部酶是饱和的，而且反响显著不行逆，而且没有产物抑制的状况，用改进双倒数法处理试验数据来测定Km和Vmax，可获得准确结果。如有必要，可用捕获剂或偶联酶使产物不断移去，迫使反响不行逆，并使产物抑制成为最小。第四节酶的分析和检测一、酶促反响初速度随[Et]的变化酶促反响的初速度随[Et]的变化而变化。通常在离体测定条件下，[Et]一般为10-12～10-7mol/L，而[St]为10-6～10-2mol/L。可将米氏方程转变为以下形式：这样，当[S]为常数时，则初速度v与[Et]成正比。但一个酶促反响速度，常因[S]的转变而转变。因此反响时间必需尽可能短，使[S]几乎处于恒态(即只有5％以下的底物形成产物)，才能得到真正的初速度，v与[Et]之间的关系才会是线性的。二、酶活力单位和比活力是指酶在肯定作用条件下，单位时间内，使底物转化的量或产物生成的量。也就是说，酶量的多少是承受其催化力量来度量；换句话说，是承受酶催化反响的速度来度量，由于在适当的条件下，v∝[E]。为了使酶单位的文献报道能统一，并具有可比性，国际酶学会议曾制订了一个标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1微摩尔底物所需的酶量为一个酶单位。所谓特定条件，温度定为25℃，pH、底物浓度等其它条件均定为最适条件。该酶单位称为国际单位〔IU)。酶制剂中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。酶的比活力(specificactivity)是指每毫克蛋白中所含的酶单位数，用U/mg蛋白表示。三、酶的转换数转换数可用两种方法表示。其一是以分子活性(molecularactivity)来定义，即在最适条件下、每摩尔酶每分钟所转变的底物摩尔数(即每微摩尔酶的酶单位数)。其二是很多酶为寡聚体。含几个亚基，因此可用另一种方式来表示转换数，即在最适条件下，每摩尔活性亚基或催化中心每分钟所转变的底物摩尔数。这两个值有时简洁以min-1表示，即：酶的kp值约在50～107min-1。碳酸酐酶是己知转换数最高的酶之一(36×106min-1)。1/kp=1.7μsec，即该酶一个催化周期为1.7微秒。第五节酶促反响的稳态前动力学一、快反响技术酶促反响动力学争论有两条途径：一是稳态动力学。它是监测整个反响，得到关于