食品分析-湖北大学第八章蛋白质和氨基酸的测定课件

蛋白质和氨基酸测定学习目标1.了解蛋白质和氨基酸的性质2.明确蛋白质和氨基酸测定方法2.掌握凯氏定氮法测定蛋白质的过程及注意事项3.了解氨基酸的性质和测定方法蛋白质和氨基酸测定内容1.概述2.凯氏定氮法3.蛋白质的快速测定法4.氨基酸总量的测定5.氨基酸的分离与测定1.概述(1)蛋白质的生理功用及在食品中的作用（2）食品中的蛋白质含量（3）蛋白质系数（4）蛋白质水解（5）蛋白质测定方法(6)氨基酸的测定与分离方法2.凯氏定氮法原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。食品中的蛋白质测定

原理、过程及试剂消化——蒸馏与吸收——滴定消化----浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾蒸馏----氢氧化钠吸收----硼酸滴定----盐酸、混合指示剂消化2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（98%）蒸馏与吸收

消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。滴定用盐酸标准溶液滴定至终点.然后进行计算.微量凯氏定氮装置蛋白质测定仪------消化、蒸馏吸收蛋白质测定仪---滴定KDN型蛋白质测定仪

QSY-Ⅱ型蛋白质测定仪

3.蛋白质的快速测定法

传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等。下面简单介绍双缩脲法1. 原理脲（尿素）NH2—CO—NH2加热至150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2

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NH2—CO—NH2方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。4.氨基酸总量的测定

（一）甲醛滴定法（二）茚三酮的比色法（一）甲醛滴定法1.原理：氨基酸本身有碱性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与—NH2—结合，碱性消失，再用强碱来滴定—COOH基。2．适用范围：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及食品中游离氨基酸的测定等。3．试剂：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性红50%乙醇溶液，④0.1mol/L氢氧化钠标准溶液。4．操作：同时取两份样：一份中加中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。另一份中加百里酚酞、中性甲醛用NaOH滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。二者之差可计算氨基酸含量（二）茚三酮的比色法

原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。5.氨基酸的分离与测定（一）薄层色谱法（二）氨基酸自动分析仪法（三）气相色谱法（四）高效液相色谱法（一）薄层色谱法原理：

取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。Rf=a/bab样点溶剂前沿点样原点操作方法：①薄层板制备②样品液制备③点样④展开⑤显色（二）氨基酸自动分析仪法（