生物样品前处理方法

生物样品前处理方法content生物样品前处理方法纯化、富集方法分析方法的限度要求生物样品前处理目的一、样品前处理的重要性

由于食品样品属于复合基质体系,多含有蛋白、油脂,碳水化合物、色素等成分,复杂的基质背景会对被分析目标化合物的提取、分离、净化和测定等带来很大的麻烦,因此食品的样品前处理不仅复杂困难,而且对于分析结果的准确可靠和灵敏具有决定性作用。为何需要样品前处理?色谱分析的误差来源

为何需要样品前处理?样品前处理所消耗时间

对于LC/MS/MS高灵敏度的仪器,适当的样品前处理对于减少基质干扰和富集组分至关重要！60%以上的工作和费用花费在样品前处理上

三个目的:

除去样品基质中的干扰物

富集组分

增强仪器的性能样品前处理原则①制备过程中避免组分发生化学变化；②要防止和避免欲测定组分的沾污；③尽可能减少无关化合物引入制备过程；④尽可能简单易行。动物细胞的破碎机械法：挤压或剪切；研磨；高压匀浆法；超声波破碎法等非机械法：酶消化法；化学渗透法；冻融法；干燥法等使用某些试剂，改变细胞膜通透性，使药物释放出来表面活性剂：对某些组分有增溶作用，有助于细胞破碎。EDTA螯合剂：与生物膜中Ca2+、Mg2+

结合，破坏原有结构。有机溶剂：高级醇、氯仿、苯等，与和平利用膜类脂质相溶，破坏生物膜。变性剂：与水中氢键作用减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水。组织捣碎机蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质内源性酸内源性酸内源性酸药药药药生物样品药2.缀合物水解3.提取、富集1.去除蛋白质3.衍生化4.衍生化加入强酸超滤法加入中性盐加热法酶水解法溶剂解法加入重金属盐二、前处理方法－－去蛋白1、溶剂解法原理：使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变

化而使蛋白质凝聚。

常用有机溶剂：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃试剂用量：溶剂体积与血样比为1～3︰1操作：有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后

离心分离，取上清液作为样品。注意采用

超速离心（12000rpm）分离1～2min2、加入中性盐原理：中性盐使蛋白质脱水而沉淀常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等试剂用量：饱和硫酸铵与血清比例为2︰1操作：样品与中性盐按一定比例混合后超速离心（10000rpm）分离1～2min，取上清液作为样品。上清液pH7.0～7.7。3、加入强酸原理：强酸与蛋白质形成不溶性盐而沉淀。常用：10％三氯醋酸、6％高氯酸、5％偏磷酸等。操作：样品与强酸的比例为1：0.6混合，离心（10000rpm）1～2min，即可。上清液pH0～4，不适于酸性下分解的药物。过量酸的排除：过量三氯醋酸可通过煮沸或乙醚提取除去；高氯酸、偏磷酸等可用碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀被除去。4、酶水解法测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物枯草菌溶素：使组织溶解，使药物析出。一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH活圈（pH7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃具有最大活力。优点：可避兔某些药物在酸及高温下降解，对与蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象。不适用于在碱性下易水解的药物。β-葡萄糖醛酸苷酶;蛋白酶羟基羧基巯基氨基缀合物葡萄糖醛酸酚羟基芳胺醇类缀合物硫酸缀合物的水解由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，所以：酸水解

可加入适量的盐酸液。

酶水解

对于遇酸及受热不稳定的药物，常用

葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶或两者的混合酶三、分离、纯化和浓缩

1、液-液萃取法

Liquidliquid

extraction,LLE

乳化现象：加固体NaCl；离心；低温冰箱中快速冻凝对于极性大的药物：离子对提取法；提取烷基化法有机溶剂(1、2)生物样品（水溶）(1)药物内源性杂质溶解度、沸点低、无毒、与水不溶：乙酸乙酯、乙醚（1.2%水）碱性药物于碱性；酸性药物于酸性。酸性；水溶性碱性；亲脂性的2、固相萃取法(solidphaseextraction,SPE)原理：不同填料作固定相的微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质后，再用适当溶剂洗脱药物。亲脂型—大孔吸附树脂，亲脂型键和硅胶规格亲水型—硅胶，硅藻土，棉纤维

离子交换型固相萃取法SPE泵甲醇柱预处理进样净化洗脱水样品弱溶剂强溶剂固相提取步骤示意图：SPE技术—填料颗粒基质硅胶基质—键合各种官能团如，{C18,C8,NH2,QMA...}不规则填料小柱(Cartridges)：

40-80

mDisks：8-10

m活性碳(AC2)表面衍生剂涂层(DNPH)聚合物基质(最新技术)—Oasis球形填料30/60

mSPE填料的类型正相填料溶剂：正己烷填料：硅胶（Silica

）氧化铝,Florisil®,氨基,二醇基…反相填料溶剂：MeOH/水填料：C18/C8/OasisHLB离子交换填料溶剂：缓冲液/盐流动相填料：AccellCM/AccellQMA/OasisMCX/MAX/WAX/WCXSPE各种填料固定相官能团C18–Si(CH3)2C18H37

tC18–SiC18H37

C8–Si(CH3)2C8H17

tC2–SiC2H5PorapakRDX-divinylbenzene/vinylpyrrolidoneAminopropyl–Si(CH2)3NH2Cyanopropyl–Si(CH3)2(CH2)3CNDiol–Si(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OHAccellPlusCM–COO2–Na+AccellPlusQMA-–C(O)NH(CH2)3N(CH3)+Cl

–DNPH-dinitrophenylhydrazineOasisHLBOasisMCXOasisMAXOasisWCX,WAX-divinylbenzene/vinylpyrrolidone-divinylbenzene/vinylpyrrolidone+SO3H-divinylbenzene/vinylpyrrolidone+CH2N+R3Cl-SilicaFlorisilAlumina正相

反相

Sep-Pak系列Oasis系列分离模式反相正相离子交换复合模式分离模式反相萃取（极性液体相，非极性改良固体相）疏水性相互作用非极性—非极性相互作用范德华力或色散力

硅胶键合C18,C8,C4，C2,-苯基等，可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到中等极性的化合物。分离模式正相萃取

（非极性液体相，极性改良固体相）亲水性相互作用极性—极性相互作用氢键π-π相互作用偶极－偶极相互作用偶极－诱导偶极相互作用

极性键合相，如硅胶键合－NH2、－CN，-Diol（二醇基）；极性吸附剂，如Silica、Florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等，可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到中等极性的化合物。正相溶剂洗脱强度己烷异辛烷四氯化碳氯仿二氯甲烷四氢呋喃乙醚乙酸乙酯丙酮乙腈异丙醇甲醇水溶剂极性图反相溶剂洗脱强度分离模式离子交换

带有电荷的化合物靠静电吸引到带有电荷的吸附剂表面按键合的离子基团的性质分类： 阳离子交换柱 阴离子交换柱按在水溶液中解离的程度：

强酸性(SCX,Strongcationexchange)

弱酸性(WCX,Weak

cationexchange)

强碱性(SAX,Stronganionexchange)

弱碱性(WAX,Weakanionexchange)分离模式反相吸附原理离子交换原理复合模式Oasis®

系列固相萃取吸附剂的演变:

从纯反相保留模式到复合保留模式(IE+RP)

NOOasis®HLBWaterwettableStableacrosspH1-14NosilanolinteractionsHydrophilicRetentionofPolarsLipophilicRPRetentionNOSO3-Oasis®MCXpKa<<11meq/gOasis®WAXNONNNNHHH++HpKa~60.6meq/gNOCH2N-C4H9CH3CH3+Oasis®MAXpKa>180.25meq/gNOCOOHOasis®WCXpKa~50.75meq/gCOO-+H+OHNCH3CH3普萘洛尔HH+反相作用强阳离子交换作用（碱性药物）MCX吸附剂NOSO-3SO-3MixedModeCation

eXchangerOasis®MCX吸附剂上碱性化合物的作用模式:Mixed-ModeCationic-eXchanger

pKa<<1O对乙酰氨基酚反相作用强阴离子交换作用（酸性药物）MAX

吸附剂NO-OHNOCH3CH2N(R3)Cl-CH2N(R3)Cl-++QuatenaryamineOasis®MAX吸附剂上酸性化合物的作用模式:Mixed-ModeAnionic-eXchangerpKa>18SPE一般性分析操作步骤活化:依次用强溶剂、弱溶剂（缓冲溶液）进行活化；上样：用能够溶解样品的弱溶剂携带样品上柱，既要保证样品分析物的有效溶解，又要确保溶剂强度不至于把被分析化合物从柱上洗脱下来；淋洗：用具有一定强度的混合溶剂淋洗去除干扰杂质，确保杂质被洗脱，而被分析化合物有效的保留在柱上；洗脱：用较强的溶剂把被分析化合物从柱上替换洗脱下来。SPE技术对流速的一般要求活化及平衡 5-10mL/min上样 0.5-5mL/min-液流不能成线清洗 1-5mL/min洗脱 0.5-5mL/min-液流不能成线与SPE产品的规格及色谱类型有关SPE使用注意事项及关键控制点

根据分析目标物的理化性质选择合适的SPE柱；一般SPE柱要防止干涸；注意控制柱载量，防止穿透过载；严格控制上样液和洗脱液滴速；防止混浊样品堵塞柱子；．．．．．．3、固相微萃取

solidphasemicroextraction,SPME基于待测物质在样品和萃取涂层中的平衡分配的过程。相似相溶原理材料：聚二甲基硅氧烷聚丙烯酸酯SPME与GC及HPLC联用4、GPC净化系统GelPermeationChromatography，GPC根据溶质分子大小进行分离的色谱技术GPC系统输液泵进样阀（自动进样器）GPC净化柱馏分收集器检测器GPC净化适用法规及推荐方法

USEPASW-846方法3640AFDA杀虫剂分析方法AOAC分析方法DFGS19

GPC净化适用法规及推荐方法方法目标物质样品基质流动相填料USEPA3640AUSEPA625-S半挥发有机物、BNA`s(BasesNeutralAcid),多氯联苯、有机氯杀虫剂环境样品、土壤、底泥等100%二氯甲烷S-X3GelFDAPesticideAnalyticalMethods有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、多氯联苯、各种杀真菌剂等脂肪、谷物、植物材料50/50乙酸乙酯/环己烷S-X3GelFDAPesticideAnalyticalMethods各种杀虫剂和除草剂脂肪食品羊毛脂50/50正己烷/二氯甲烷S-X3GelAOACMethodsofAnalysis有机氯农药动物、鱼、家禽、、植物油品50/50环己烷/二氯甲烷AOACMethodsofAnalysis有机氯和有机磷杀虫剂、,三嗪化合物、氨基甲酸盐化合物动物、鱼、家禽、、植物油品15/85二氯甲烷/环己烷S-X3GelFDAPesticideAnalyticalMethods有机氯有机磷杀虫剂、多环芳烃脂肪、谷物、植物材料70/30乙酸乙酯/环戊烷S-X3GelGB/T19650-2005动物组织中农药多残留分析农药动物组织50/50乙酸乙酯/环己烷S-X3Why“GPC”?

减少对仪器的损害和待机时间提高准确率，确保平行性。提高效率，并且回收率稳定提高回收率提高仪器的检出限节约溶剂节约人力应用实例：在土壤样品中16种多环芳烃混合标准品，萃取浓缩后以LabTechGPCCleanup