冻藏温度对低温冻藏型草鱼肌原纤维蛋白变性的影响

冻藏温度对低温冻藏型草鱼肌原纤维蛋白变性的影响

鱼肌肉的食用质量和保存加工特性与蛋白质的生化特性密切相关。长期以来,国内外研究人员对鱼类尤其是海水鱼类蛋白质在冻藏过程中的生化特性变化和鱼肌肉蛋白质冻结变性机理进行了大量系统深入的研究,取得了很多有益的成果。大量研究表明鱼肌肉蛋白质在冻藏过程中的变性与新鲜度、冻藏温度、pH值、脂肪氧化、氧化三甲胺还原产生的二甲胺和甲醛等因素密切相关。其中,冻藏温度是最重要的影响因素,冻藏温度越低,鱼肌肉蛋白质冻结变性速度越慢。近年来,鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)养殖业发展迅速,产量逐年递增,目前单一的活鱼销售方式很难满足鲈鱼产量快速增长的要求。因此,鲈鱼的保鲜和加工将是水产加工业面临的1个重要问题。作者在前文中研究了鲈鱼在微冻条件下的鲜度变化规律,本文将以肌动球蛋白(MA)含量,Ca2+-ATPase活性,Mg2+-ATPase活性,Ca2+-Mg2+-ATPase活性,Mg2+-EGTA-ATPase活性,巯基(-SH)含量作为蛋白质生化特性指标,考察不同冻藏温度对鲈鱼肌肉蛋白质生化特性的影响,以期为鲈鱼的冻藏加工提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面活鲈鱼(中国花鲈Lateolabraxjaponicus,海水养殖)购于农贸市场,重量524～630g。1.2方法1.2.1蛋白质生化特性测定活鱼即杀后,将鱼肉沿脊椎取下,切成2cm见方的鱼丁,装入保鲜袋后,分别冻结到中心温度-10℃,-20℃,-30℃和-40℃,然后分别置于(-10±0.5)℃,(-20±0.5)℃,(-30±0.5)℃和(-40±0.5)℃下保存。每隔15d进行1次蛋白质生化特性指标的测定。冻鱼肉流水(15℃)解冻20min左右,然后用组织捣碎机(DS-1)捣碎,用于指标测定。1.2.2肌动蛋白提取按文献的方法进行。1.2.3肌动球蛋白的测定采用双缩脲法进行测定。1.2.4关于pma活性的测定按文献的方法进行,测得的磷酸标准曲线如图1所示。1.2.5式shmol/l的计算按Benjakul等人的方法进行。巯基含量用公式SH(mol/L)=A/c×11计算。其中A表示吸光度值,c表示分子吸光系数,其值为13600/(mol/L)·cm,11表示稀释倍数。1.2.6实验数据处理上述实验均重复1次,所得实验数据进行单因素方差统计学分析。2结果与讨论2.1冻藏过程中不同部位鱼肌动从变化到变化鲈鱼在不同温度下冻藏时肌动球蛋白盐溶性的变化如图2所示。在-10℃和-20℃下冻藏时鲈鱼肌动球蛋白的溶出量一直呈快速下降趋势。在-10℃下冻藏时,前30d内肌动球蛋白的溶出量从21.78mg/g迅速下降到3.8mg/g,下降速率达0.599mg/g·d;在-20℃下冻藏时,前60d内,肌动球蛋白的溶出量从21.78mg/g迅速下降到2.7mg/g,下降速率达到0.318mg/g·d,远远高于冻藏后期的下降速率(分别为0.127mg/g·d和0.059mg/g·d)。在-10℃下冻藏时,第60d的鲈鱼肌肉中已几乎提取不到肌动球蛋白了。在-30℃和-40℃下冻藏时,鲈鱼肌动球蛋白溶出量在前30d的冻藏期内不仅没有下降,反而有所上升,但是变化不明显。从第30d起,-30℃下冻藏的鲈鱼肌动球蛋白溶出量开始下降。在冻藏75d之后,下降速率明显加快,达到0.576mg/g·d。实验结束(至90d)时,肌动球蛋白的溶出量为9.16mg/g,远远高于在-10℃和-20℃下冻藏相同时间的鲈鱼肌动球蛋白溶出量。-40℃下冻藏的鲈鱼,其肌动球蛋白溶出量在30d之后呈缓慢下降趋势,下降速率为6.5×10-2mg/g·d。到第90d时,肌动球蛋白的溶出量仍高达到20.18mg/g,仅比鲜活鱼肉的值低1.6mg/g。引起冻藏过程中肌动球蛋白溶解性下降的因素有多种,比如由于蛋白质的部分结合水形成冰晶而析出,导致肌动球蛋白分子之间相互形成非共价键,进而形成超大分子的不溶性凝集体使肌动球蛋白溶出量下降。另外,肌原纤维蛋白变性后,会产生1种在高离子强度下不溶解但在碱液中可以溶解的蛋白质,即碱溶性蛋白质,也会导致肌动球蛋白在冻藏过程中溶解性的下降。Sompongse等认为巯基氧化形成的二硫键会导致肌球蛋白重链的聚合,从而降低其盐溶性。从图2和图7可以看出,鲈鱼肌动球蛋白的溶出量在不同温度下冻藏时的下降趋势与其巯基含量的变化存在相关性。因此,可以认为鲈鱼在冻藏过程中肌动球蛋白溶出量的下降是由于巯基氧化形成二硫键所致。从图2中也可清楚地看出冻藏温度对鲈鱼肌动球蛋白溶出量有显著的影响。至第30d时,在-10℃下冻藏的鲈鱼肌动球蛋白的溶出量已降为3.8mg/g,而在-20℃下冻藏的鲈鱼肌动球蛋白的溶出量仍高达15.91mg/g;至第60d时,-20℃冻藏下的鲈鱼肌动球蛋白的溶出量降至2.7mg/g,而-30℃下冻藏的鲈鱼肌动球蛋白的溶出量仍达到19.51mg/g;到第90d实验结束时,-30℃下冻藏的鲈鱼肌动球蛋白的溶出量也降至9.16mg/g,而-40℃下冻藏的鲈鱼肌动球蛋白的溶出量还保持在20.18mg/g的较高水平,差异极其显著(p<0.01)。许多研究也得到了相似的结论。另外,从图2中可以看到,在-30℃和-40℃下冻藏的鲈鱼肌动球蛋白溶出量在0～30d之间均出现了上升趋势。其他研究者也观察到类似情况。笔者认为此现象可能是由于提取方法不完善所致。由于在较低的温度下冻藏时冻藏前期肌动球蛋白变性较轻微,提取方法对实验值的影响较大,因而导致-30℃和-40℃下冻藏的鲈鱼肌动球蛋白溶出量出现了上升趋势。基于此,作者认为不宜单独将肌动球蛋白的盐溶性作为评价其变性的指标。2.2冻藏过程中3种atpase活性的变化ATPase活性的变化鲈鱼在不同温度下冻藏时ATPase活性的变化如图3～6所示。由图3可知,在-10℃下冻藏的鲈鱼肌动球蛋白的Ca2+-ATPase活性,Mg2+-ATPase活性,Ca2+-Mg2+-ATPase活性和Mg2+-EGTA-ATPase活性均随冻藏时间的延长而下降,且变化趋势基本相似,在前30d内下降速度非常快。尤其是前3种ATPase活性的下降速度几乎一致。到第30d时,Mg2+-EGTA-ATPase活性仅剩下0.02μmol/mg·min,到第45d时,Ca2+-ATPase活性,Mg2+-ATPase活性及Ca2+-Mg2+-ATPase活性也几乎完全丧失了。从图4可知,在-20℃下冻藏时,鲈鱼肌动球蛋白的Ca2+-ATPase活性,Mg2+-ATPase活性及Ca2+-Mg2+-ATPase活性在前45d内的下降速率较快,3种ATPase活性的下降速率基本相同。从第45d开始,下降速率变慢。到第75d时,上述3种ATPase活性已基本消失。Mg2+-EGTA-ATPase活性在前15d冻藏期内下降速率较快,从第15d开始下降速率放慢,到第60d时活性基本丧失。从图5可知,在-30℃下冻藏时,除Ca2+-ATPase活性外,Mg2+-ATPase活性,Ca2+-Mg2+-ATPase活性大体呈均匀下降的趋势,下降速率分别为1.15×10-2μmol/mg·min·d和1.12×10-2μmol/mg·min·d。Ca2+-ATPase活性在15～45d之间存在快速下降期,下降速率达2.5×10-2μmol/mg·min·d,其他区间的下降趋势与Mg2+-ATPase活性和Ca2+-Mg2+-ATPase活性基本相似。Mg2+-EGTA-ATPase活性在前15d的下降趋势较快,此后则基本上呈缓慢下降趋势,到第60d时,Mg2+-EGTA-ATPase活性已接近0μmol/mg·min。由图6可知,在-40℃下冻藏时,鲈鱼肌动球蛋白的Mg2+-ATPase活性及Ca2+-Mg2+-ATPase活性在大体呈匀速变化趋势,它们的线性回归方程分别为y=-0.0058x+1.134和y=-0.0057x+1.096。从回归方程可以推知2种ATPase活性完全丧失的时间分别为195d和192d,而且可以推知实验结束(90d)时,2种ATPase的活性分别为0.612和0.583μmol/mg·min,与实测值(0.64和0.579μmol/mg·min)基本相符。Ca2+-ATPase活性在前15d的下降趋势较缓慢,下降速率仅为5.0×10-3μmol/mg·min·d,从第15d起开始快速下降,下降速率提高到9.6×10-3μmol/mg·min·d。Mg2+-EGTA-ATPase活性在前30d下降非常缓慢,30～60d之间下降速率加快,此后一直缓慢下降,至第60d降为0μmol/mg·min。引起冻藏过程中鱼肉肌原纤维蛋白质ATPase活性下降的原因有多种解释。Hatano认为是由于冰晶的机械作用引起的;也有很多研究者认为是由pH值下降引起的;还有许多学者认为巯基氧化形成二硫键导致的分子聚合是ATPase活性下降的主要原因。作者认为,由于冻藏温度越低,pH值下降越慢,因此,在-10℃和-20℃下冻藏时鲈鱼肌原纤维蛋白质ATPase活性下降是由巯基氧化和pH值下降2个因素作用的结果,而在-30℃和-40℃下冻藏时则主要是由巯基氧化引起的。冻藏温度对鲈鱼肌原纤维蛋白质ATPase活性下降速率存在显著的影响。鲈鱼肌动球蛋白Ca2+-ATPase,Mg2+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase及Mg2+-EGTA-ATPase活性在不同冻藏温度下的平均下降速率如表1所示。统计学分析表明,不同冻藏温度之间的差异极其显著(P<0.01)。另外,在4种温度下冻藏时,Mg2+-EGTA-ATPase活性均比其他3种ATPase活性消失得更早。表明鲈鱼原肌球蛋白—肌钙蛋白复合体非常容易变性。2.3冻藏过程对身份证基含量的影响鲈鱼在不同温度下冻藏时巯基含量的变化如图7所示。从图7可以看出,在前15d的冻藏过程中,-10℃和-20℃下冻藏的鲈鱼之间,-30℃和-40℃下冻藏的鲈鱼之间,巯基含量下降速度差异不大。从第15d开始,不同温度下鲈鱼巯基含量下降速度出现了显著差异(P<0.01)。在-10℃下冻藏时,鲈鱼巯基含量在15～30d内急剧下降,由0.698μmol/g下降到0.072μmol/g。在-20℃下冻藏时,鲈鱼的巯基含量在15～45d期间快速下降,巯基含量由0.75μmol/g下降到0.03μmol/g。在-30℃下冻藏时,鲈鱼巯基含量下降速度从第15d开始突然加快,第60d后逐渐减慢。到第90d时,巯基含量仍达0.41μmol/g。在-40℃下冻藏时,鲈鱼巯基含量在前45d几乎不变,而后以极为缓慢的速度下降。到90d的冻藏期结束时,巯基含量依然高达0.814μmol/g,比初始含量下降了0.331μmol/g,平均下降速率仅为3.7×10-3μmol/g·d。巯基含量在冻藏过程中下降的原因可能是冰晶的形成使得肌原纤维蛋白空间结构发生改变,使埋藏在分子内部的巯基暴露出来,进而被氧化成二硫键,导致巯基含量的减少。冻藏温度对鲈鱼巯基含量的变化影响极其显著。冻藏至第30d时,-10℃下