中国海域腹泻性贝毒的研究现状

中国海域腹泻性贝毒的研究现状

腹泻性核毒症（sd）是由有毒红藻和原甲藻中毒引起的脂肪多环聚醚类生物活性物质。它可以丰富食物中的其他过滤动物，并危害食用者的健康。腹泻性贝毒在全球沿岸海域均有分布,是世界范围内具有严重威胁的赤潮藻毒素之一。腹泻性贝毒DSP在我国存在比较普遍,近年来每年均有发现腹泻性贝毒的报道,危害有不断加重的趋势。近年对我国沿海部分海域贝类毒素分布调查显示,在渤海湾、胶州湾、莱州湾、秦皇岛、广东沿海和福建等海域均发现了DSP。迄今为止我国已有多种贝类污染腹泻性贝毒。传统上腹泻性毒素主要包括三大类:酸性的大田软海绵酸(okadaicacid,OA)和它的衍生物鳍藻毒素(dinophysistoxins,DTXs);中性的扇贝毒素(pectenotoxins,PTX1-10);含双硫酸基的虾夷扇贝毒素(yessotoxins,YTXs)。由于YTXs,PTXs在贝中通常与OA和DTXs同时检出,尽管在结构和毒性作用机理上与OA和DTXs等存在差异,但一直以来也被归为腹泻性贝类毒素。最近几年随着研究的不断深入,许多研究者认为继续将YTXs和PTXs归为腹泻性贝毒组分是不合适的,如YTXs既不能引起腹泻,也不能抑制蛋白磷酸酶2A的活性,却对人的肝脏、心脏、神经系统有损伤。2004年3月FAO/IOC/WHO在都柏林举行的关于贝类生物毒素会议上,重新按化学结构将贝类生物毒素分为8组,包括azaspiracid,brevetoxin,cyclicimines,domoicacid,okadaicacid,pectenotoxin,saxitoxin和yessotoxin,YTXs,PTXs等毒素从腹泻性贝毒中分出来分别成为专门的一类毒素。YTX是含有2个磺酰基的多环聚醚类化合物(图1),1986年首次从采自日本陆奥(Mutsu)湾的虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)的消化腺中分离得到,之后在世界上许多国家和地区的贝类和藻类中都检测到了YTXs。到目前为止已有近100种YTX同系物从浮游植物和贝类中被发现[12,13,14,15,16,17],但是只有大约40种YTXs的结构通过核磁共振(NMR)和/或液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)等技术和方法得以确定。目前已报道能产生YTXs的藻类有3种:网状原角藻(Protoceratiumreticulatum)、多边舌甲藻(Lingulodiniumpolyedrum)和具刺膝沟藻(Gonyaulaxspinifera)。图2和表1中列举了目前世界上在贝类和藻类中检测到YTXs的国家和地区。腹泻性贝毒及其贝体内与其共存的YTXs,PTXs,GYM等毒素是对人类健康具有极大潜在威胁的海洋生物毒素,因而对生态环境及水产养殖业形成严重的威胁。我国对以上毒素的研究比较滞后,只有一些使用小鼠生物法检测的报道以及几篇液相衍生荧光检测贝类样品的报道。在我国贝类中已发现的腹泻性贝毒成分仅有软海绵酸OA和鳍藻毒素DTX-1,这可能是不够重视,研究得比较少,另外标准物质的匮乏也限制了对以上毒素的研究。为了了解我国贝类中存在的腹泻性贝毒及其他毒素成分,我们采用高效液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS/MS)方法对我国海产贝类中的贝毒组分进行分析。2材料和方法2.1样品检测和分析方法贝类样品来自国家专项“九○八”———赤潮、海洋病原生物和外来生物入侵灾害调查与研究(908-01-ZH3)课题在全国沿海采集的贝类样品。从常规小鼠生物法呈DSP毒素阳性的样品中挑选了12个毒性最大的样品,对这些样品进行HPLC-MS/MS分析,采样站位和贝类种类见表2。样品的处理过程如下:将贝样去壳匀浆,取2g匀浆加入8mL萃取液(80%的甲醇与水的体积分比数)超声10min,离心,将上清用0.45μmPTFE一次性针管滤器过滤后用于HPLC-MS/MS分析。2.2检测条件及方法小鼠生物法(mousebioassay,MBA)参照中华人民共和国进出口商品检验行业标准《出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法》,SN0294。操作过程简述如下:取120g贝肉匀浆,加入360mL丙酮,超声10min,离心取丙酮上清液。丙酮溶液经真空低温浓缩,蒸去丙酮,之后加入少量水,用乙醚萃取两次,合并有机相。低温真空蒸去乙醚,用含1%吐温60的生理盐水定容6mL(20g贝肉与1mL0.5%吐温60的生理盐水之比),配成高浓度注射液。必要时可将原液稀释4倍或16倍的低浓度来计算毒性。取贝毒提取物原液或经稀释后的注射液1及0.5mL,根据腹腔注射法注射到昆明种小鼠(18~20g)体内,每组剂量处理3只,观察24h,求出每组3只死亡2只以上的最小剂量,计算毒性大小。液相色谱-质谱系统:API365三重四极杆质谱检测器;自动进样器ShimadzuSIL-10AD;泵ShimadzuSIL-10AT(2);色谱柱LunaC18(2)5μ,150mm×2.0mm;保护柱为Phenomenex。液相色谱条件:流动相A为5mmol/dm3甲酸胺,53mmol/dm3甲酸,乙腈与水的体积比(10∶90);流动相B为5mmol/dm3甲酸胺,53mmol/dm3甲酸,乙腈与水的体积比(90∶10);流速为0.3mL/min;进样体积为20μL;梯度洗脱程序如表2中所示。质谱条件:采用两种不同的分析模式来分析样品中的毒素成分(见表3)。用阴离子模式来检测YTXs,OA和DTX1,质谱各项参数为雾化气(nebulizergas,NEB)13,幕帘气(curtaingas,CUR)12,电喷雾电压(ionsprayvotage,ISV)-4500、碰撞气(collisiongas,CAD)8,入口电压entrancepotential(EP)-8,碰撞室出口电压(collisioncellexitpotential,CXP);用阳离子模式来检测PTX,AZA,和GYM,检测参数为NEB14,CUR8,ISV3000,CAD4,EP10,DP50,FP200,TEM450,CXP15。以多反应监测(MRM)方式扫描来检测。待测毒素的检出限和定量限用微克每千克贝组织匀浆来表示,各毒素的检出限和定量限分别为:OA(0.8和3.5);PTX-2(0.1和0.6);GYM(0.02和0.07);AZA-1(0.2和0.8);YTX(0.4和1.5)。2.3标准物质本研究所用的贝类毒素标准物质均购自加拿大国家海洋生物研究所。2.4超纯水系统的制备所用试剂均为分析纯或色谱纯,实验用水用美国研制的Millipore-QRG超纯水系统(ultrapurewatersystem)制备得到。2.5制剂量与毒力关系表小鼠试验法中贝类提取物毒性大小是参照中华人民共和国进出口商品检验行业标准《出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法,SN0294》中的注射剂量与毒力关系表计算得到;液相色谱-质谱检测结果中由于没有YTX衍生物的标准物质,故对于HomoYTX,45-OH-YTX,45-OH-homo-YTX的定量是假设在相同的扫描模式下YTX的衍生物具有同YTX相同的摩尔质量响应来完成的。3ytxs具有长期残留毒副反应效应从12个样品中的8个检出YTXs毒素。发现北黄海、大连附近海域的海湾扇贝和虾夷扇贝含有25~41μg/kg的YTX,该海域的虾夷扇贝体内还含有37.2μg/kg的45-OH-YTX,并且在海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎、毛蚶、缘齿牡蛎等5种贝中检测到微量的Homo-YTX毒素组分,从另有一个样品检测出含有GYM毒素(表4)。这是首次报道在我国贝类中检测到YTXs毒素。从图3和表4中可以看出,YTX主要分布在我国北方海域,而YTX两种衍生物(Homo-YTX和45-OH-YTX)在我国南方海域和北方海域均有分布,原因可能主要与贝类种类不同有关。Mackenzie等的研究发现,YTX在新西兰绿壳贻贝体内的半衰期为49d,但在挪威的紫贻贝(Mytilusedulis)中的半衰期仅为20d,这可能与不同的贝对YTX的代谢途径/方式不同,不同的代谢途径又与贝的生理状态、有毒藻种类、季节及水体温度有关。由于检测的样品数量有限,YTXs毒素真正的存在与分布状况可能会与本研究结果不同,关于我国YTXs毒素的分布特点尚需作大量深入的研究。目前人们对YTXs毒素的毒性作用机理了解得非常少。YTXs毒素对实验小鼠口服毒性很低,甚至口服YTX浓度高达5mg/kg体重时,也没有观察到实验鼠明显的不适反应,但是也有研究认为,YTXs的降解代谢相当缓慢,它可以在贝体中至少存留几个月以上,而在这个时间内其他腹泻性毒素成分已经逐渐代谢排出,这表明YTXs是一种长期残留的毒素成分,具有长期毒性效应。另外由于YTXs常与OA,DTXs等腹泻性毒素共存,像OA可以增强GYM的毒性一样,OA等毒素可能也会增强YTXs的毒性,对食用者的健康造成威胁。目前可得到的研究数据表明,心脏、肝脏、神经系统、免疫系统、细胞溶酶体、胸腺等可能都是YTX的作用靶器官,而且作用过程和机制极其复杂,目前对它尚没有确切的了解,毒性作用可能主要与Ca2+相关,能作用于Ca2+通道蛋白,同时也对线粒体有一定作用。关于YTX的长期暴露毒性、生殖毒性、致癌性以及遗传毒性更是没有得到毒理数据,欧盟2002年规定贝类中几种YTXs的允许限量为1mg/kg(YTX,45-OH-YTX,homoYTX和45-OH-homo-YTX),关于YTXs长期、低剂量暴露的毒性对健康风险也日益引起极大关注。腹腔注射毒性研究显示,YTX腹腔注射致死剂量在不同的实验室间差别大,从100μg/kg到750μg/kg体重不等。本研究中含有YTX的3个样品(1个海湾扇贝和2个虾夷扇贝)的脂溶性提取物的生理盐水(含1%的土温60)溶液注射到小鼠的腹腔,几分钟内3只鼠立刻出现摇晃、串动、抽搐等症状,然后翻躺、不动,在6h内全部死亡;注射含YTX和45-OH-YTX的虾夷扇贝毒素,1min后3只鼠出现上述症状,在3min30s内3只鼠全部死亡。连把毒素稀释4倍进行注射,3只鼠中2只15h内死亡,另一只24h活力很差,按毒力标准表计算,毒性为0.2MU/g。参考3个样品中OA,DTX-1,PTXs,AZAs和GYM等毒素的LC-MS/MS检测结果表明,这3个样品不含上述这些毒素成分,因此本研究得出的YTXs对鼠的腹腔注射致死剂量比文献报道的低很多,以含有YTX和45-OH-YTX的虾夷扇贝结果计算,20μg/kg(体重)的YTXs就能导致实验鼠死亡,但是在小鼠试验法中,由于DSP的提取过程复杂,易受杂质干扰,再加上所用鼠的品系、鼠的体重和生活状态不同也会产生不同的结果,另外毒素提取物中高不饱和脂肪酸等物质也极易引起假阳性结果,所以本研究中YTXs的腹腔注射致死剂量可能是多种因素共同作用的结果,而不仅仅是毒素本身造成的。已报道YTXs的生物来源主要是3种甲藻:网状原角藻、多边舌甲藻和具刺膝沟藻。网状原角藻曾在新西兰(3万个细胞每升)和挪威海域(2200个细胞每升)形成赤潮,同时在赤潮发生的海域从贝中检出高浓度的YTX;2007年青岛沙子口海域曾发生具刺膝沟藻赤潮(个人交流资料);2005年蓝东兆等报道在我国福建湾底泥中发现了网状原角藻的孢囊。在本研究同步采集的沉积物中,在8个YTXs阳性站位中的7个发现了上述3种藻的孢囊(表5),只有2007年7月采集于汕头南澳的沉积物中未发现上述3种产生YTXs的甲藻孢囊,但在采集于同一站位