利用b淋巴细胞杂交瘤技术制备麻痹性贝毒的单克隆抗体

利用b淋巴细胞杂交瘤技术制备麻痹性贝毒的单克隆抗体

麻痹性苦艾酒，晋江，是一种含有双冠维c的三氟乙醇（图1），具有四羟吡啶的基本结构。晋江分布在世界各地。根据不同的地理分布，主要成分也不同。最常见的是膝沟藻素（gonama3、gtx2、sabistax）和石脑藻素（sabistax）。stx通常占sd的85%以上。stx是邢氏家族的主要研究对象。因此，在该项目中，stx是半抗原生动物检测psp的单克隆抗体。PSP在弱酸和低温条件下比较稳定,通常的烹调方法不能改变其结构及降低其毒性,主要污染滤食性贝类,污染的贝类被人类食用后,会产生四肢面部肌肉麻痹、头痛恶心等症状,严重时可窒息死亡。由于PSP分布广泛、危害严重,引起各国的普遍重视,因此建立快速、灵敏、有效地毒素检测方法显得十分迫切。目前国际上普遍使用的贝毒监测方法主要是生物小鼠法和高效液相色谱法(HPLC),但生物法存在误差性大、重现性差,且存在不能分析样品中具体组分的缺点;而HPLC法能够精确地测定毒素的种类和含量,但需要对样品进行繁琐的前处理和购买昂贵的设备。因此,海洋生物样品中麻痹性贝毒的监测就受到了严重的限制。酶联免疫吸附检测方法(Enzyme-linkedimmolunosorbentassay,ELISA)克服了上述技术的局限性,为我们提供了一种快速、敏感而且操作简单的分析方法,在小分子化合物的检测中应用已经十分广泛。本研究旨在制备可用于检测海洋生物体内的PSP的单克隆抗体,对于研发国产PSP检测试剂盒具有重要的意义。1材料和方法1.1材料表面1.1.1细胞和实验动物骨髓瘤细胞株SP2/0由本室保存。动物为6～8周龄雌性BALB/c小鼠(体重18～21g),购自大连医科大学实验动物中心。1.1.2tmb底物溶液STX标准品(台湾人宇公司);其他PSP系列标准溶液均购自加拿大海洋生物科学研究所(NRC);血蓝蛋白(KLH),卵清白蛋白(OVA),牛血清白蛋白(BSA),二甲基亚砜(DMSO),聚乙二醇(PEG),HAT、HT培养液均购自Sigma公司;TMB底物溶液(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、磷酸盐-柠檬酸缓冲液、过氧化脲、EDTA-2Na、DMSO)为本实验室自行配制;RPMI1640和胎牛血清购于Gibco公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG(华美生物工程有限公司)。二氧化碳培养箱(ThermoFormaSeriesⅡ)、倒置显微镜(Nikon100),超净工作台(CA-1390-1),高速冷冻离心机(Sigma3K18),微量移液器(Gilson),快速高压灭菌锅(TomySS-325),电热恒温培养箱(DNP-9272),酸度计(PHS-2C),鼓风干燥箱(GZX-9000),酶标仪(BIO-RADModel680),洗板机(Thermolabsystems)。1.2方法1.2.1血蓝蛋白al-4天进阶,在形成良好的血蓝蛋白上,将其作为蛋白胶原,将0.5mg石房蛤毒素STX溶于250μlPBS缓冲液(pH=6.5)中,加入75μl37%的甲醛,迅速加入500μl血蓝蛋白KLH(10mg/ml),25℃,振摇37小时,4℃过夜后,PBS缓冲液(pH=6.5)透析3天,用做免疫抗原。包被抗原STX-OVA偶联方法同上。1.2.2单次注射x-drh以STX-KLH为免疫原,免疫5只6～8周龄的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用75μlSTX-KLH与等体积完全弗氏佐剂,充分乳化后,注射腹腔小鼠,第3、5、7、9、11周取同量STX-KLH与等体积不完全弗氏佐剂充分乳化,腹腔注射。每次注射前由尾部取血测定小鼠血清的效价,待效价大于要求值后,融合的前3天,取100μlSTX-KLH的PBS溶液腹腔注射进行加强免疫。1.2.3酶标板的测定用STX-OVA偶联物作为包被抗原,用碳酸盐缓冲液(pH=9.6)稀释到适当浓度添加到96孔酶标板,每孔100μl,4℃过夜;弃去残液,洗涤三次、拍干,96孔酶标板每孔加入300μl封闭液,37℃孵育3小时,封闭好的96孔酶标板可保存在4℃数周待用;测定时,弃去封闭液,洗板三次,拍干,加入适当稀释的血清或细胞培养上清,每孔100μl,37℃温箱中孵育1小时;从温箱中取出酶标板,洗板、拍干,加入适当稀释的酶标羊抗鼠第二抗体,每孔100μl,37℃温箱中孵育40分钟;洗板、拍干,每孔加TMB底物溶液100μl,37℃孵育10～20分钟,以0.05mol/LH2SO4每孔50μl中止反应,450nm波长测定OD值。1.2.4elisa检测抗pvc的细胞系取生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫好的小鼠脾细胞按照1∶5的比例进行混合,加入促融剂PEG0.7ml进行细胞融合,在20%胎牛血清的HAT培养基中选择性培养,融合后的第3天换半液,4～6天有细胞克隆形成,取细胞培养液上清进行ELISA检测,选取阳性细胞孔,用有限稀释法克隆,筛选可稳定分泌抗PSP的单克隆抗体的细胞系,阳性孔需要经过连续克隆3～4次,最后一次克隆后检测阳性率为100%时,则所得细胞株即为分泌单克隆抗体的阳性细胞株。阳性细胞经扩大培养后,用于腹水制备和液氮长期保存。1.2.5elisa法检测阳性杂交瘤细胞的及其有效发挥取6～8周龄雌性BALB/c小鼠6只,每只腹腔注射0.5ml液体石蜡,1～2周后可用于注射杂交瘤细胞制备腹水。1200r/min离心10分钟收集阳性杂交瘤细胞,用生理盐水调节细胞浓度为2×107个/ml,在液体石蜡处理过的小鼠腹腔内注射0.5ml阳性细胞悬液,注射7～10天后可见小鼠腹部明显膨大,收集腹水,3000r/min,4℃,离心10分钟,收集上清液即为含单克隆抗体腹水,用间接ELISA方法测定腹水效价,-84℃超低温冰箱冻存备用。1.2.6修订2.5mol/lPSP系列标准溶液包括:①C毒素标准工作液:C1(5.7μmol/L)、C2(1.75μmol/L);②膝沟藻毒素Gonyautoxins(GTXs)标准工作液:GTX1(2.65μmol/L)、GTX2(2.95μmol/L)、GTX3(0.975μmol/L)、GTX4(0.875μmol/L)、GTX5(1.625μmol/L)、dcGTX2(2.85μmol/L)、dcGTX3(0.8μmol/L);③石房蛤毒素Saxitoxins(STXs)标准工作液:neo-STX(6.5μmol/L)、dcSTX(6.2μmol/L)、STX(6.5μmol/L),将上述PSP用PBS稀释成各浓度的使用液:15.625、31.25、62.5、125、250、375和500ng/ml共7个梯度。1.2.7标准曲线的绘制96孔板的包被和封闭见1.2.3。测定时弃去封闭液,洗板3次,每孔加入50μl稀释的腹水和50μl系列稀释的各种标准物质溶液或待测样品溶液,振荡混匀,37℃孵育1小时,其他步骤同血清或上清效价测定。以加入不同浓度的PSP系列标准物孔的吸光度值与空白对照孔的吸光度值比为纵坐标,相应的PSP系列标准的浓度为横坐标,绘制标准曲线,计算出各标准物抑制率为50%时所需的浓度即IC50,交叉反应率为STX的IC50与其它同系物IC50的比值。交叉反应率=ΙC50SΤXΙC50同系物×100%。1.2.8催化剂和仪器称取一定量的贝类样品匀浆,用0.1mol/L的盐酸溶液按照1∶1萃取,煮沸5分钟,8000r/min离心20分钟,取上清液,孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤,HPLC分析。HPLC条件为:GTX毒素流动相(主要针对GTX1～GTX5、dcGTX2和dcGTX3):4.3mmol庚烷磺酸钠与10mmol磷酸铵的混合液,磷酸调pH至7.1,0.45μm过滤;STX毒素流动相(主要针对STX、neoSTX和dcSTX):2mmol庚烷磺酸钠与30mmol磷酸铵的混合液,磷酸调pH至7.1,0.45μm过滤膜:乙腈(20∶1);流速:0.8ml/min;进样量:5μl;HPLC-FLD检测器激发波长和发射波长分别为330nm和390nm;氧化剂:7mmol高碘酸与50mmol磷酸钾混合液,以磷酸调节pH至9.0;酸化剂:0.5mol/L醋酸;流速:柱后氧化剂流速0.4ml/min,酸化剂流速为0.4ml/min;柱后反应温度:75℃。1.2.9生物大鼠法分析xml按照中华人民共和国国家标准“贝类中麻痹性贝类毒素的测定”中规定的方法进行(GB/T5009.213-2008)。2结果2.1stx-glh偶联比由于合成的STX-KLH首次免疫过后,剩下的合成抗原在第二次免疫时,3只鼠均死亡,且临死时均有典型的麻痹性贝毒上串抽搐而死的特征表现,计算出PSP含量为43.4eqSTXμg/100g。据此得出STX-KLH偶联比为STX∶KLH=10∶1。为防止分解,每次免疫之前现合成免疫抗原,包被抗原也如此。2.2免疫大鼠血清效果以STX-KLH为免疫抗原,免疫8次后两只BALB/c小鼠血清对STX-OVA的效价均在400左右。2.3阳性混合肿瘤的细胞株2.3.1elisa法检测抗体表达免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用PEG融合,每只鼠20块96孔细胞板,HAT培养基筛选培养,当每孔杂交瘤细胞覆盖孔底30%～50%时,ELISA方法检测细胞培养上清中抗体分泌情况,阳性率为4.5%。其中仅有8个阳性细胞孔有较明显抑制作用,将上述8个阳性细胞孔进行有限稀释法克隆,最终获得4株能稳定分泌抗PSP特异性抗体的杂交瘤细胞株,命名为17#E8、17#D8、17#G6和17#F9。经过连续传代10代及冻存1个月后复苏、ELISA效价检测显示该细胞株分泌抗体仍为强阳性,效价与原代细胞一致,证明这4株细胞具有稳定分泌抗体的能力。2.3.2抗体的活性4株阳性细胞扩大培养后,细胞上清液的吸光度值见表1,结果表明该杂交瘤细胞株具有能分泌较高浓度的PSP抗体的能力。通过小鼠腹腔注射阳性细胞株诱生腹水的方法,4株杂交瘤细胞株均能诱导出高效价的含抗PSP单克隆抗体的腹水,细胞株17#E8和17#F9诱生的腹水效价均在2×104以上(图2)。2.4间接竞争elisa方法分析了psp的不同组成部分2.4.1x-ova的稀释和浓度用点阵法确定了竞争ELISA方法的包被抗原STX-OVA最佳稀释度为1∶500;腹水的稀释倍数为1∶1000;HRP标记的羊抗鼠二抗的浓度为1∶1000;底物显色液的时间为18分钟。2.4.2标准物质的检测以抗原STX标准溶液浓度对数为横坐标,结合率为纵坐标,绘制结合率反应标准曲线(图3)。线性回归方程为y=-0.1696x+1.4901,R2=0.9785。求出抑制率为50%时所需的STX标准物质浓度(IC50)为220ng/ml,对STX组分的检出限为20ng/ml。用间接竞争ELISA方法检测PSP系列其余标准物质的抑制反应(图4),从中可以看出该抗体对其余PSP组分几乎没有抑制,仅对GTX2/3有明显的抑制效果,IC50为50ng/ml,检出限为10ng/ml。由上述结果可知,该抗体对GTX2/3的交叉反应率为440%,其他组分交叉反应率均低于1%。表明所制备的单克隆抗体对PSP中的STX组分和GTX2/3组分具有高特异性。2.5成对t检验结果分别用HPLC方法、生物小鼠法与ELISA方法分析78个贝类生物样品,用SPSS11.0软件分别进行成对t检验分析,结果显示:HPLC方法与ELISA方法在针对GTX2/3组分的检测时,相关系数为0.9082、在针对PSP的检测时,相关系数为0.8647;用生物小鼠法与ELISA方法在分析贝类体内PSP含量时,相关系数为0.8611。3elisa法测体外蛋白中n-b、n-pb-l近些年来,免疫检测技术在抗生素、农药和毒素等小分子化合物残留分析中的应用越来越广泛,而抗体的制备则是建立免疫检测技术的关键。由于PSP各组分的分子量均在300Da左右,没有免疫原性,合成高质量的人工抗原较困难;STX标准品价格昂贵,来源渠道极少,限制了关于建立PSP的ELISA分析方法的研究。抗原合成的原则是半抗原与载体蛋白的偶联位置最好远离重要的抗原决定簇,从而使远离联结位点的半抗原部分具有较好的识别能力,进而获得效价高、特异性好的抗体,本实验以甲醛通过缩水反应分别将蛋白质KLH、OVA的氨基与STX的胍基连接起来,成功合成了具有免疫原性的免疫抗原和包被抗