黄芪对小鼠的作用机制研究

黄芪对小鼠的作用机制研究

黄鼠尾科植物。蒙古黄色。性味,甘,归肺、脾经,具有补气固表,利尿解毒,排脓,敛疮生肌之功。现代药理研究表明,黄芪具有利尿、强心、增加免疫力等多种作用,目前对黄芪增强免疫力,强心等研究比较多,但是对黄芪的利尿作用研究的比较少。本实验采用盐水负荷实验模型,对黄芪及其不同组分的利尿作用进行评价,筛选中药黄芪利尿作用的有效组分,为制定黄芪与临床疗效的质量标准奠定良好的基础。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验动物使用昆明种小鼠,SPF级,雌雄各半,体质量(20±2)g,由广东省医学实验动物中心提供。饲养于SPF级动物实验室,室温23~25℃,相对湿度40%~70%,每小时换新风15次,广东省实验动物使用许可证号:SYXK(粤)2008-0002;饲料由广东省医学实验动物中心提供。1.1.2全自动电解质仪ZH-B6型小鼠代谢笼(淮北正华生物仪器有限公司);XD-685全自动电解质仪(上海迅达公司);小鼠Na+-K+-ATP酶ELISA试剂盒(南京建成生物有限公司,批号:20130506)1.1.3原料和诉讼规格黄芪饮片:广州至信中药饮片有限公司出品,批号:13050;氢氯噻嗪片:世贸天阶制约(江苏)有限责任公司,批号:20130524。1.2制备1.2.1水先冷浸制备称取药材黄芪粗粉300g,加8倍量水先冷浸30min,回流提取2次,每次2h。合并2次提取液,浓缩至含生药浓度1g/mL,冷藏备用。1.2.2黄芪多糖的分离纯化称取药材黄芪粗粉1kg,加入8倍量水,回流提取2次,每次2h,采用水蒸气蒸馏法,获得黄芪挥发油组分。合并提取液减压浓缩至200mL,加入无水乙醇使醇沉浓度为90%,加入量为5倍体积,沉淀4h,收集上清液和沉淀,沉淀加少量水溶解,水浴挥至无醇味,选用AB-8大孔吸附树脂吸附,30%乙醇洗脱,得到黄芪多糖组分。将上清液加热挥至无醇味,加水至100mL,依次用3倍量石油醚、乙酸乙酯,正丁醇萃取3次,分别合并各萃取液,减压浓缩得乙酸乙酯组分和正丁醇组分。其中挥发油组分主要含有芳香酯类化合物,乙酸乙酯组分主要为黄酮类成分,正丁醇组分主要为皂苷类成分。1.3福利试验方法1.3.1动物用药实验筛选正常尿量的小鼠84只,随机分为空白组,阳性组,挥发油组分组,乙酸乙酯组分组,正丁醇组,多糖组和水提液组,共7组,每组12只。每只小鼠给药体积为0.15mL/10g,根据《中国药典》2010版规定黄芪临床用药剂量为15~30g,根据《实验动物方法学第三版》将黄芪按小鼠与人1日服用剂量30g进行换算,得出每只小鼠服用剂量为4.28g生药/kg,各组分按其在生药中含量同等剂量给予,空白组给予同体积的蒸馏水,阳性组给予氢氯噻嗪25mg/kg,各给药组动物均灌胃给予相应的药物,连续灌胃7d,每天1次。1.3.2小鼠尿中na+、k+、cl-的测定实验前禁食不禁水24h,轻压小鼠腹部将余尿排尽,各组小鼠均用1mL生理盐水灌胃作为水负荷,30min后灌胃给予各组药物,记录给药时间,为防止尿液蒸发,在尿液收集器中加入3mL蒸馏水,并以空白代谢笼为对照。将小鼠放入小鼠代谢笼中,每小时称量1次,记录水负荷小鼠4h的排尿量(尿液收集器重量—空白尿液收集器重量),用XD-685全自动电解质仪测定尿中Na+、K+、Cl-的浓度。尿液收集完毕后,马上进行腹主动脉取血,并取肾脏,用ELISA法测定Na+-K+-ATP酶。1.4组t表示应用SPSS13.6分析软件,计量资料均以(ue0af±s)表示,组间比较采用t检验。P<0.05时2组间有显著性差异,P<0.01时2组间有极显著性差异。2结果2.1尿量及说基因型指标与空白组相比,用第1小时尿量作为指标,阳性药,乙酸乙酯组分,正丁醇组分和水提液具有显著的利尿作用(P<0.05);用第2小时尿量作为指标,阳性药具有极显著的利尿作用(P<0.01),乙酸乙酯组分具有显著的利尿作用(P<0.05);用第3小时尿量作为指标,各组均无统计学差异;用第4小时尿量作为指标,正丁醇组分具有显著的利尿作用(P<0.05);用4h总尿量作为指标,阳性药有显著利尿作用(P<0.05),其余各组均无差异,见表1。2.2k+排出量的影响与空白组相比,阳性药在Na+、Cl-排出量上极显著增加(P<0.01),在K+排出量上显著减少(P<0.05);乙酸乙酯组分在Na+排出量上显著增加(P<0.05),在Cl-排出量上极显著增加(P<0.01);正丁醇组分和水提液在Na+、Cl-排出量上显著增加(P<0.05),见表2。2.3乙酸乙酯对各小鼠血清atp酶活力的影响与空白组相比,阳性组的全血和肾脏ATP酶活力都极显著减少(P<0.01);乙酸乙酯组的全血和肾脏ATP酶活力都显著减少(P<0.05);正丁醇组的全血ATP酶活力显著减少(P<0.05),其余各组无差异,见表3。3尿激素水解反应黄芪能补气固表,利尿解毒,临床上常用黄芪补脾利尿的作用治疗气虚水湿内停之肢体面目浮肿,小便短赤者,常与白术、防己等同用,如防己黄芪汤,而且现代药理证明黄芪对肾炎蛋白尿具有一定的治疗作用。与西药相比,中药利尿药作用缓和持久,是寻找良好利尿药的重点探究方向,并且基于中药组分复杂如黄芪,关于利尿物质基础研究较少等特点,本文利用代谢笼法,选用尿量、尿液离子及Na+-K+-ATP酶等指标对黄芪水提液及其组分做了深入的研究。尿液作为最直观的指标,可以直接反应药物是否具有利尿作用。结合表1可以发现乙酸乙酯组分在前2h都有显著的利尿作用,且作用较水提液持久,正丁醇组分利尿作用比较持久,这可能与黄芪乙酸乙酯组分中含有较多中等极性的黄酮类化合物和正丁醇组分含有较多皂苷类成分有关,而从尿量也可以得出黄芪黄酮类化合物与皂苷类化合物有可能为利尿的优势组分。尿液离子可以反应机体电解质的状态,也可以一定程度上说明药物利尿的作用机制。从表2的实验结果表明黄芪水提液,乙酸乙酯组分及正丁醇组分Na+、Cl-排出量上极显著增加。氢氯噻嗪的Na+、Cl-排出量及Na+/K+值显著升高,并且3种离子的损失都较为严重,在临床使用中都应注意补充3种离子以维持机体电解质的平衡防止出现低钠低钾血症,这也表明在长疗程的应用中,黄芪水提液,乙酸乙酯组分及正丁醇组分可能较为适用。有研究表明Na+-K+-ATP酶跟利尿密切相关,当抑制Na+-K+-ATP酶活性的量为16.0μg/mL时,可促进水、氯化钠、尿素与尿酸的排泄。而从本实验结果看乙酸乙