基于rapd技术的18个三色堇自交系的遗传多样性分析

基于rapd技术的18个三色堇自交系的遗传多样性分析

三色堇，又名蝴蝶花和鬼脸花，是早春的一种重要花卉。目前三色堇品种十分繁多,各品种类群间的遗传关系十分复杂,要进一步培育新品种,弄清各品种类群间的遗传关系是十分必要的。传统上常通过外部形态特征来研究品种间的遗传关系,但形态特征易受环境的影响而使结果出现偏差。RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA),即随机扩增多态性DNA技术,能从DNA水平上分析不同个体之间的差异,不受栽培环境等因素的影响,目前已在园林植物的亲缘关系研究方面有了一些应用。在堇菜属RAPD研究方面,Lee用RAPD技术标记了韩国堇菜属的3个亚属,Oh曾用RAPD技术来区分堇菜属中的不同种;但用RAPD研究不同三色堇品种或自交系间的遗传关系则尚未见报道。基于分子标记的遗传距离用于杂种优势的预测在园艺作物上已有了较多的应用。本试验拟采用RAPD技术,研究18个三色堇自交系的遗传关系,为杂交新品种的培育提供必要的遗传资料。同时研究三色堇RAPD遗传距离与多个观赏性状的杂种优势、性状值和配合力之间的相关关系,以期为三色堇杂种优势预测提供理论依据。1材料和方法1.1交系的主要特点RAPD扩增试验用的三色堇(Violawittrockiana)18份自交系均由本实验室2000~2004年自交得到,其编号、来源与主要观赏特点见表1。田间试验选用其中5个性状已比较稳定的F4或F5代自交系3、8、9、12、18,来源分别是欧洲(3、8、9)、中国(12)与美国(18),具有一定的代表性。1.2调查与统计方法采用Griffing双列杂交方法2进行杂交试验,自交系于2004年3月杂交得到F1代种子,2004年9月将亲本与F1播种于穴盘,10月中旬定植于直径17cm的瓦盆,随机区组设计,3次重复。2005年3月16日(盛花期)进行10个性状的测量与统计。这10个性状分别是:花径,以花心为中心,分别测花的横径与纵径,取二者平均值;花数,每植株所具有已开放的花朵总数;花葶长,从花葶基部到花朵基部的长度;分枝数,每植株所具有的长度大于5cm的分枝总数;株高,自植株基部至顶端的自然高度;株幅,植株最宽幅度与最窄幅度的平均值;高/幅,即株高与株幅之比;叶型指数,叶长与叶宽之比;开花指数,由公式:花数×(花径/株幅)2计算而来;叶面积,由椭圆叶片计算公式:(1/4)π(叶长×叶宽)计算而来。1.3pcr反应动力学三色堇总DNA提取参照项艳等的方法。RAPD反应在PTC-100基因扩增仪上进行。所用引物为Operon、Sangon及Bioasia公司产品,均为10碱基随机引物。扩增反应体系为:10mmol·L-1Tris-HCl(pH9.0),50mmol·L-1KCl,每种0.2mmol·L-1dNTP,2.5mmol·L-1MgCl2,0.4μmol·L-1引物,40ng模板DNA,1.2UTaqDNA聚合酶(大连宝生),反应体积为20μL。扩增反应程序为:94℃预变性2min,然后按程序:94℃30s,36℃30s,72℃1.5min扩增40个循环,最后在72℃延伸10min。扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶中电泳1.5~2.0h,电泳液为1×TAE,在凝胶中加入0.5μg·mL-1EB。电泳后在紫外灯下观察照相。1.4rapd扩增回复突变试验pcrRAPD扩增谱带按有(1)和无(0)记录,根据Nei相似系数计算任意两样品间的相似系数F=2NXY/(NX+NY),NXY为品种X和Y经RAPD扩增反应分子量相同的谱带总和,NX、NY分别代表品种X、品种Y经RAPD扩增反应的谱带总数,遗传距离GD=1-F,再根据遗传距离利用UPGMA法构建遗传聚类图,bootstrap自展500次,计算运用FREETREE软件进行。双列杂交资料按刘来福等的方法进行方差分析,并估算一般配合力与特殊配合力效应值。杂种优势根据下列公式计算:中亲优势HP=F1/MP-1;超亲优势MP=F1/BP-1。其中F1为F1代杂种性状值,MP为中亲值,且MP=(P1+P2)/2,P1、P2分别为亲本1与2的性状值,BP为优亲值。用SAS软件计算RAPD遗传距离与杂种表型值、杂种优势和特殊配合力的相关系数。2结果与分析2.1rapd扩增图谱的建立及聚类分析21个引物共扩增出167条带,多态性带127条,多态性比例为76.05%,说明不同的自交系间有丰富的遗传多样性。引物与基因组DNA随机结合,最多扩增出13条带,最少有2条带,21个引物平均扩增的条带数为7.95,扩增产物的分子量集中在0.2~2.0kb之间。图1是引物M14的RAPD扩增图谱。根据Nei的计算公式,计算出18个自交系间的遗传距离矩阵,其中自交系间最大的遗传距离是0.32,最小的仅有0.02,说明这些自交系间的遗传差异变化范围较大。根据遗传距离值,用系统聚类法对18个自交系进行聚类分析,得到UPGMA树状聚类图(图2)。从图中可以看出,18个自交系可以分为5大类,自交系1、14较为特殊,是与其它材料有明显区别的小花类型,分别列为一类,且自交系1得到了100%的bootstrap自展值支持,说明这一分类是相当可靠的;C类群基本都由来自欧洲的品系组成,而D类群则由来自美国的品系组成,但它们的bootstrap值都不高;自交系3与13单独聚为一类,但未得到高度的bootstrap值支持。从自交系的自交来源来看,来自同一原始材料的自交系往往聚在一起,而且有高的自展值支持,如自交系6和7,自交系10和11,自交系15、16和17,说明RAPD在鉴别三色堇的亲缘关系时是比较可靠的。2.2营养性状表现为10个性状的杂种优势值见表2。花部性状中,花径各杂交组合均呈正向优势,其中组合12×18杂种优势值最大,优势最为显著,其次8×12,9×18也有较大的优势,而3×8、3×12的优势则较小;花数从总体来看,杂种花数相对于优亲是下降的,但不同组合杂交优势表现差异很大,如12×18高达1.10(MP),显示了强烈的优势,而3×12则为-0.23,有较强的负向优势;花瓣厚多数杂交组合呈正值,表现出一定的杂种优势;开花指数多数杂交组合呈负值,但组合8×12、12×18有较大的优势,说明这两个组合的观赏性有较大的提高。营养性状中,株幅的中亲优势均为正值,且优势较大,但具有亲本12的杂交组合其超亲优势较小或为负值,如3×12,8×12,是因为自交系12本身具有较大的株幅;株高的超亲优势很小,说明杂种后代株高趋向高亲。不同杂交组合叶面积的杂种优势一般较小或为微弱负值,而分枝数则普遍有大的优势。总体来看,多数性状都有正向的杂种优势,而且株幅、分枝数等营养性状都有较大的优势,表明在三色堇的杂种后代中杂种优势是一个较为普遍的现象,这与齐鸣的研究结果类似。杂交组合8×12、12×18在花径、花数、开花指数、花瓣厚等主要观赏性状上都有较大正向优势,可作为优良的杂交组合扩大繁殖。2.3rapd遗传距离对三色抗杂性能的影响对双列杂交后资料进行配合力方差分析。由于杂交组合9×18缺失,因此在分析中剔除了自交系9及其杂交后代。结果显示在调查的性状中,株幅与花数的一般配合力方差达到显著水平,而其余的均未达显著水平;花径与花数的特殊配合力方差达到显著水平,而其余的均未达显著水平(数据未列出)。因此在相关分析中只分析了株幅与花数的一般配合力和花径与花数的特殊配合力与RAPD遗传距离及杂种优势的相关性。根据RAPD数据计算Griffing试验中5个自交系亲本的遗传距离矩阵,5个自交系之间的遗传距离都较小(平均0.223),其中3与12的距离最大(0.255),8与9或9与12的距离最小(0.191)。自交系UPGMA聚类树见图3,可见8与9遗传距离最小,而3与其它自交系亲缘关系较远。遗传距离与杂种表型值、杂种中亲优势、杂种超亲优势、一般配合力和特殊配合力的相关系数见表3,其中亲本的平均遗传距离用该亲本的所有组合双亲间遗传距离平均值表示,用于与亲本的一般配合力的分析。由表3可知,由RAPD计算得到的遗传距离与绝大多数性状的相关性不显著,表明不能用RAPD遗传距离可靠地预测三色堇的杂种优势。但是值得注意的是,RAPD距离与花数的F1代表现值、中亲优势、超亲优势的相关系数均达到0.1的显著水平(p值分别为0.092、0.069、0.058),且决定系数分别为0.55、0.40、0.42,说明RAPD遗传距离在花数的形成中占有较大的比例,因而用RAPD遗传距离预测花数的杂种优势具有一定的可靠性。特殊配合力与中亲优势、超亲优势的相关关系达到极显著的水平,而且决定系数也较高(表4),说明三色堇中用特殊配合力预测杂种优势的可靠性很高。但RAPD距离与一般配合力、特殊配合力的相关关系不显著,说明用RAPD距离也不能有效的预测配合力。3讨论3.1聚类分析结果三色堇传统上一般按花径大小分为巨大花系、大花系、中花系与小花系,又可按花色斑的有无分为纯色类、杂色类,还可按用途分为盆花类和切花类。从本试验的结果来看,这18个三色堇自交系的分类与花径的关系较大,小花与大花的类型基本上被分开,与地理来源也较一致,因此可根据这两方面的资料初步判断三色堇的遗传差异,这与上述花径的分类标准较为一致。但色斑有无与RAPD分类不太吻合,如无色斑的自交系10、11没有与自交系9聚为一类,它们与其它有色斑的自交系也没有孑然分开,可能是因为这一性状只由少数的基因或主效基因控制,在RAPD数据中难以起到主要的作用。聚类结果与各自交系的来源也有一些差异,如自交系3来自品种‘SwissGiantEveningGlow’,却与其它‘SwissGiant’系列的自交系划分开来;自交系2来自‘SwissGiantRedWing’,却与来自‘JokerOrange’的自交系4聚为一类。造成这一现象的原因则可能是因为三色堇育种时期较长,育种地区也很广泛,它的异交习性和长期的人工杂交选育使不同品种间的血缘关系甚为复杂,因而有可能出现品系内的遗传距离反而比品系外大的现象。但值得注意的是它们都是来自欧洲的品种,与美国亲缘的自交系明显分开,显示了地理差距在亲缘关系分化中的作用。3.2rapd标记的局部杂合性分子标记用于杂种优势的预测已有了较多的研究,但多数研究的预测效果因实验材料、研究手段的变化而不同甚至相反,表明用分子标记的遗传距离预测杂种优势离实际应用还很远。Bernado从理论上分析了分子标记预测杂种优势的效果,认为要有效地预测杂种优势必须满足以下条件:①显性作用较强;②亲本自交系间位点杂合;③性状遗传力高;④平均亲本所有位点的频率变化范围窄;⑤至少30%~50%的QTL与分子标记连锁;⑥不超过20%~30%的分子标记随机分布或与QTL无关。可见,用分子标记准确地预测杂种优势较困难。从本实验结果来看,三色堇的RAPD遗传距离与各性状的杂种优势相关性很弱,仅与花数有达到0.1水平的相关性,说明简单地用RAPD遗传距离预测三色堇的杂种优势是不适当的。可能的原因是:①扩增的RAPD位点偏少,不足以覆盖全部基因组,降低了遗传距离计算的精度;②RAPD标记包含了与相应