液相色谱法和高效液相色谱法

《仪器分析》液相色谱法高效液相色谱法

LiquidChromatographyForShort：LCHighPerformanceHP液相色谱法基础知识液相色谱仪的维护主要内容液相色谱仪的主要部件色谱基础知识色谱起源石油醚碳酸钙颗粒混合色素色带分离组分1903年俄国植物学家

M.S.Tswett提出经典液相色谱

色谱基础知识色谱法：利用组分在两相间相互作用不同而进行分离的技术流动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相，色谱柱色谱定义色谱是一种分离技术色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量

根据流动相和固定相的状态，分为：色谱的分类吸附色谱

根据分离原理，分为：色谱的分类分配色谱离子交换色谱空间排阻色谱柱色谱：填充柱、毛细管柱平面色谱：纸色谱、薄层色谱色谱的分类

根据固定相外形，分为：液相色谱法基础知识液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子和热稳定性差的化合物的分离分析（70-80%化合物）流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用什么是HPLC?是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段：高精度、耐高压的输液泵，高性能的色谱柱，高灵敏度的检测器……广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业……HPLC的特点

分离性能好、选择性高（同分异构、旋光异构）

灵敏度高（10-9～10-12g）

分析速度快（15-30min）

进样量小（1-100uL）输液泵柱温箱进样器检测器数据处理系统液相色谱仪的主要部件储液瓶高压输液系统数据处理系统输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器储液瓶HPLC简易流程图输液泵液相色谱对泵的要求：1.流速稳定平滑，并且重现性好。2.可靠且充分的溶剂混合。3.有效的流速范围，在0.1~10mL/min的范围内可以连续调节。4.密封性能好，耐腐蚀，容易清洗。5.能适用于梯度洗脱。柱塞式往复泵

等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂适用于组分较少的化合物分析混合器比例阀二元高压梯度四元低压梯度脱气机梯度洗脱ABABCD前端峰分离度差

甲醇/水=8/2分析时间长，后端峰展宽灵敏度下降甲醇/水=6/495%30%甲醇浓度缩短分析时间，峰形好

等度洗脱效果

梯度洗脱效果输液泵进样器储液瓶高压输液系统进样器自动进样器手动进样器取样位置时(Load)进样位置时(Inject)样品进入液相分析柱手动进样器——六通阀进样器输液泵柱温箱进样器储液瓶高压输液系统柱温箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性

填料：如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球等色谱柱分类反相色谱柱：C18、C8正相色谱柱：硅胶、氰基、氨基离子交换色谱柱：SCX、SAX凝胶色谱柱：凝胶手性色谱柱：牛血清蛋白、AGP、环糊精等C18柱的使用注意点柱压应低于柱子的承受压力柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃缓冲液pH使用范围为2～7硅胶在PH为3～4时稳定性最好碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。输液泵柱温箱进样器检测器数据处理系统储液瓶高压输液系统常用检测器紫外检测器（UV）二极管阵列检测器（PDA）荧光检测器（FL）示差折光检测器蒸发光散射检测器紫外检测器（UV）EinEoutA=eCl

=-log(Eout/Ein)

朗伯比尔定律检测池C:浓度l原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收优点：1）灵敏度高

2）对温度和流速不敏感

3）可用于梯度洗脱4）不破坏样品，可与其他检测器串联缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质二极管阵列检测器（PDA）原理：普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检。得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。色谱图光谱图吸光度波长时间荧光检测器（FL）原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光，基于被分析组分发射的荧光强度进行检测。基态激发态S1S0激发（1）振动能（2）发射（3）优点：1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器

2）选择性好

3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）

液相色谱仪的维护HPLC的环境设置HPLC的日常操作条件：温度：10～30℃相对湿度：<80％最好是恒温、恒湿远离高电磁干扰、高振动设备有良好的通风设施流动相的选择采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对样品有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配溶剂等级水的等级超纯水蒸馏水去离子水波长(nm)因为不纯物的存在，去离子水的吸光率较高超纯水中去除了无机和有机的污染物吸光率超纯水去离子水溶剂等级HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：1专门的超纯水机；2去离子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用类似家用的净水器；5市场上瓶装的纯净水或蒸馏水（乐百氏纯净水）；6其它途径。溶剂等级

不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，放置时间越短，水质越高。理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。有机溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45µm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒）优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2µm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质溶剂等级甲醇乙睛正己烷分析纯级(实线）和HPLC级溶剂（虚线）的吸光度比较溶剂等级溶剂等级缓冲盐的使用：

使用前必须过滤使用后一定要对柱子进行清洗，以免造成腐蚀、磨损及阻塞：首先用纯水冲洗10-30min，再用甲醇冲洗30min(0.5-1ml/min)

易受到细菌和霉菌的影响

注意冲洗次序，不能直接用有机溶剂冲洗溶剂前处理过滤：0.45µm或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小物理颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其在使用无机盐配制的缓冲液的时候必须过滤。脱气：除去溶解在流动相中或彼此混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波溶剂前处理样品处理使用适宜的流动相溶解样品在溶剂选择的时候，应注意以下原则：

--减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰的流动相

--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在色谱柱中产生沉淀

2.进样前最好使用0.45µm的膜进行过滤如果样品很脏，要使用0.2µm的膜进行过滤泵的保养使用流动相尽量要清洁；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；流动相更换时要防止沉淀；

避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。色谱柱的保养1、在使用新柱之前，