补肾清毒法治疗慢性乙型肝炎患者树突状细胞表型及功能的变化

补肾清毒法治疗慢性乙型肝炎患者树突状细胞表型及功能的变化

中国是高发病率的地区。一般人群的HBsAg阳性率为9.09%。目前认为,CHB患者体内DC功能受损,可能导致HBV感染慢性化。我们依据多年治疗经验,认为从“伏邪温病”的理论解释CHB的发病和症状更为合理,并发现“补肾清毒法”具有明显修复肝功能的作用。因此,我们继续运用“补肾清毒法”治疗CHB并观察治疗前后外周血树突状细胞表型和功能的变化情况,探讨其改善CHB患者免疫功能的作用。1数据和方法1.1hbvna检测2008年4月-2009年12月期间广州中医药大学第一附属医院门诊就诊的CHB患者49例,其中男37例,女12例,平均年龄25.86岁。病例均经ELISA检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc,PCR法检测HBVDNA。其诊断符合2005年12月制订的《慢性乙型肝炎防治指南》。纳入标准:HBsAg和HBeAg持续阳性半年以上;HBVDNA阳性(斑点杂交法),HBVDNA载量>105copies/ml;血清ALT持续波动于正常上限2～5倍达6个月以上。排除标准:丙型肝炎、丁型肝炎、艾滋病、失代偿性肝病;产妇或哺乳期妇女;半年内曾使用过抗病毒药物及免疫调节剂者。将49例患者随机分为两组,其中补肾清毒法治疗组28例,核苷类似物治疗组21例,两组患者在年龄、病程、ALT、HBVDNA方面比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表l。另取10例健康人作为正常对照组。1.2细胞术和细胞仪淋巴分离液(Ficoll,1.077g/mL)购自Axis-shield公司;RPMI-1640培养液、DPBS购自GIBCO公司;胎牛血清(FBS)购自PAA公司;牛血清白蛋白5g(BSA)购自Roche公司;重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF1×107μ/mg)、重组人白细胞介素4(rhIL-45×106μ/mg)、重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α2×107μ/mg)、重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α2×107μ/mg)均购自Peprotech公司;异硫氰酸荧光素标记抗人CD80、CD83、HLA-DR单克隆抗体与藻红蛋白标记抗人CD86单克隆抗体购自Biolegend公司;异硫氰酸荧光素标记抗人HLA-A2单克隆抗体购自Cyclex公司;二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;丝裂霉素C(MMC2mg)购自Roche公司。BeckmanCoulter流式细胞仪为ALTRA公司产品。显微照相系统IX70为日本Olympus公司产品。1.3方法1.3.1药物、试剂及仪器补肾清毒法组:桑寄生、旱莲草、小叶凤尾草、丹参、茵陈各20g,杜仲、山栀子各15g,叶下珠30g,甘草5g。1剂/d,水煎为250ml,温服。核苷类似物组:拉米夫定(葛兰素史克)100mg/次,口服,1次/d。两组疗程均为24周。1.3.2重组人基细胞培养使用肝素抗凝管收集CHB患者及健康人外周血30ml,用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC,加入含10%FBS的RPMI-1640培养液重悬,计数,按细胞数(2～6)×106/孔接种到6孔培养板中,培养体积3ml。在37℃、5%CO2细胞培养箱中温育2小时,去除未贴壁细胞,获得贴壁的PBMC。1.3.3冷冻储存本身的pb腹泻将上述未贴壁细胞离心,加入配好的冻存液,置于4℃冰箱1小时,-20℃冰箱2小时,-80℃冰箱过夜,第2天转液氮保存。1.3.4含细胞因子的培养按照Roman等分离培养DC的方法稍作修改。贴壁单核细胞,每孔3ml加入完全培养基RPMI-1640(含10%胎牛血清),按rhGM-CSF100ng/ml和rhIL-4500U/ml的终浓度加入细胞因子。置37℃,5%CO2培养箱继续培养。第3天、第7天半量换液1次(含细胞因子rhGM-CSF100ng/ml和rhIL-4500U/ml)。第9天每孔再添加各10μlrhTNF-α(10ng/mL)及rhIL-1β(10ng/ml),共培养11天,于第11天收集DC。1.3.5独立显微镜观察在每次换液时,用倒置显微镜观察培养孔中的DC细胞形态特征变化,并摄像记录。1.3.6添加不同类型标记管收集培养至11天的DC,洗涤后计数配成2×105个细胞/ml加入流式标记管,分别向对应管加入FITC-CD80、CD83、HLA-DR、PE-CD86各5μl。阴性对照设一管,同型对照加入isotypeantibody,4℃孵育30分钟,用流式细胞仪检测上述DC表面分子。1.3.7自体t细胞融合及酶活性检测收集培养11天的DC,用25μg/ml的丝裂霉素C于37℃处置45分钟后,PBS洗涤3次,悬浮于完全RPMI1640培养基中,使DC的数量为1×104个细胞/孔加入96孔圆底培养板。用正常人DC作对照组,每组各3个复孔。每孔按照DC与淋巴细胞数量为1∶100、1∶40、1∶10、1∶5的比例再加入复苏后的自体T淋巴细胞,终体积200μl/孔,并继续在37℃、5%CO2细胞培养箱混合培养5天。培养结束后,沉淀细胞吸出上清液,-20℃保存备检。加入MTT(5mg/ml)20μl/孔,37℃孵育4小时后,吸出液体(剩余少许在孔内),加入DMSO100μl/孔,1小时后用酶标仪在550nm波长处测OD值。刺激指数(SI)=试验孔OD值/空白孔OD值。1.3.8上清液配制分别收集纯的DC培养上清液和AMLR上清液,-20℃保存备检。ELISA法检测的细胞因子包括IL-10和IL-12,按照试剂盒提供的操作步骤进行。1.4统计方法数据用均数±标准差表示,组间比较采用方差分析和配对t检验,用SPSS13.0版软件系统分析。2结果2.1细胞因子的细胞PBMC培养2小时后见圆形扁平贴壁细胞;培养24小时后可见贴壁单核细胞均匀地分布成细胞聚体,粘附于培养板底,尤以边缘为著;加入细胞因子(GM-CSF、IL-4)培养3～4天可见部分细胞呈梭形或不规则形状,第7天加入TNF-α后,细胞成簇现象增多,可以见到形状不规则、带有毛刺状突起的悬浮细胞,随着时间的延长,成簇的细胞团散开,在培养10～11天时即可以看到细胞表面有明显的毛刺状突起,即为具有典型DC形态的悬浮细胞。两组DC的体外增殖情况见图1。2.2分别标记标记培养11天的DC,直接用FITC标记的抗人MHC-II类抗原(HLA-DR)、CD80、CD83和PE标记的抗人CD86单克隆抗体分别标记。用流式细胞仪分析显示:CHB患者HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达率普遍降低,其DC表达共刺激分子的水平明显低于正常人群(P<0.05)。治疗24周后,两治疗组HLA-DR、CD80、CD83、CD86表达率均较治疗前提高(P<0.05);补肾清毒法组HLA-DR、CD80、CD86表达率高于核苷类似物组(P<0.05);CD83比较无统计学意义(P>0.05)。见表2。2.3chb患者dc刺激t细胞增殖的能力,c采用自体淋巴细胞用于自体混合淋巴细胞反应中,健康人与CHB患者各5例,DC与自体淋巴细胞按照1∶100、1∶40、1∶10、1∶5的比例混合培养,其刺激指数(SI)分别为(1.60±0.13)VS(1.23±0.05)、(2.20±0.14)VS(1.67±0.03)、(1.46±0.15)VS(0.52±0.09)、(1.67±0.08)VS(0.62±0.15)。CHB患者DC刺激T细胞增殖的能力在各培养比例中均低于健康人,差异有统计学意义(P<0.05)。且发现在1∶40的混合比例下,健康人和CHB患者的刺激指数均达到最高值,与本组其他混合比例比较差异有统计学意义(P<0.05)。所以我们按照DC/T为1:40的比例进行余下实验。CHB患者经过24周的治疗,补肾清毒法组的刺激指数为1.277±0.17,核苷类似物组刺激指数为1.786±0.21,经治疗后两治疗组的刺激指数仍低于健康人,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。2.4两组患者治疗前后il-12变化情况比较AMLR上清液中健康人组IL-12水平高于CHB患者,差异有统计学意义(P<0.05),而IL-10比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。接受治疗前,两组患者IL-12比较无统计学意义(P>0.05)。治疗12周后,核苷类似物组IL-12高于补肾清毒法组(P<0.05)。治疗24周后,两组分别与治疗前比较,IL-12有明显升高,比较有统计学意义(P<0.05)。而两组组间比较,无统计学意义(P>0.05),见表4。3平台治疗chb患者的活性“伏邪温病”则是指某些具有邪气伏藏,逾时而发,发时即表现为里热症状的温病。HBV具有垂直传染的特征,在围生(产)期和婴幼儿时期感染HBV者中,分别有90%和25%～30%将发展成慢性感染,此当为先天肾虚不足所致。HBV感染慢性化过程与清代温病医家柳宝诒的“肾虚邪伏”学说所描述的相一致:即邪盛侵入机体,是因肾虚,邪伏于至虚之处,暗耗正气所致。而伏邪发病,往往是人体正气充盈鼓荡,或时气的引发。中医又有“肝肾同源”的理论,因此我们提出CHB发病机理为“肾虚疫毒内伏肝血”,故当采用补肾清毒的治疗方法。DC是至今发现的人体内功能最强的专职抗原提呈细胞,也是惟一能激活纯真T淋巴细胞(naiveTcells)的抗原递呈细胞,是机体免疫反应的始动者,在特异细胞免疫中起十分重要的作用。有研究表明,CHB患者体内DC功能受损,可能导致HBV感染慢性化。近年来研究发现,CHB患者细胞免疫在辅助性T细胞(Th)、DC及细胞因子等多方面均存在异常,与乙型肝炎慢性化有密切关系。国内外的大量研究表明,CHB患者外周血DC数量减少、表型不成熟、功能下调,我们的实验也证实了CHB患者DC存在表型表达率下降的情况。DC分子表面标志的表达率可作为DC的抗原提呈能力的参考指标之一,要全面评价DC的功能是否得到恢复或者上调,单凭其表面标志的表达水平无法作出准确判断,而混合淋巴细胞反应是DC刺激增殖功能评价的一个常用技术。因此,我们还选用了自体混合淋巴细胞反应,目的是为了评价同一患者治疗前后或抗原负载的DC,对自体淋巴细胞的增殖是否具有增强作用。我们的研究表明,CHB患者经补肾清毒法和核苷类似物治疗24周后,HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达率均较治疗前升高(P<0.05),但仍普遍低于健康人。DC表型的经典分子表面标志中的CD80和CD86是协同共刺激分子,为T/B细胞的活化提供重要的第二信号,在治疗24周后,补肾消毒法组HLA-DR、CD80、CD86表达高于核苷酸类似物组(P<0.05)。同时,CHB患者经两种方法治疗后DC的刺激增殖指数(SI)均有所升高,与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05),但仍低于健康人的刺激指数(P<0.05)。由此,我们认为长期运用补肾清毒法较核苷类似物能更好的改善DC的表型,促进其提高抗原递呈能力。IL-12是DC细胞释放的最有效的CTL和自然杀伤细胞活性刺激因子,在机体抗病毒和抗肿瘤等一系列免疫病理条件下均能发挥关键作用。而IL-I0是一种抑制性细胞因子,它可以通过抑制DC分化成熟及抑制IL-12的分泌来降低DC的抗原提呈功能。我们发现治疗前CHB患者IL-12水平较健康人低,而IL-10未见明显差异,结合DC的表型表达率特别是DC成熟的重要标志CD83的表达率和AMLR刺激指数的实验结果,说明CHB患者DC的成熟、抗原递呈能力和刺激T淋巴细胞增殖能力下降。经补肾清毒法治疗的CHB患者,IL-12水平上升趋势在治疗后期比较明显,提示补肾清毒法改善DC功能是一个长期的作用。同时,治疗前后CHB患者IL-10水平无明显改变,与IL-12变化未见明显相关性,提示外周血DC分泌IL-12下降及治疗后改善可能存在其他机制。有研究表明,Treg可在体外诱导DC共刺激分子CD80和CD86的下调,且幅度非常明显,原因是Treg抑制了DC对T细胞增殖反应的诱导。另一研究发现,Treg在HBV携带者外周血和肝脏活检标本中的水平明显高于H