酶工程课件：电泳

第四章酶的提取与分离纯化预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。初步纯化（roughfractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化（finefractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。第三节电泳

电泳（electrophoresis,EP）：

指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。一、电泳的基本理论

1.原理:

在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。

+-

迁移率与内在特性和外界条件有关内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性

将带净电荷Q的粒子放入电场，受到的电引力为：

F引=EQ

在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻

F阻=6πrηV

当F引=F阻时EQ=6πrηVEQV=6πrη

影响迁移率的因素：1）颗粒性质：

Q越大、r越小、形状越接近球形，v越快。2）电场强度：E越高，v越快。3）溶液性质：

pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，v越低。原因：离子氛（ionicatmosphere）。通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。自由界面电泳：指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。2.电泳的分类按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：②醋酸纤维素薄膜电泳：。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。

③琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。

3.电泳常用设备

（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。

常压电泳仪（600V）

高压电泳仪（3000V）

超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽：

自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：

水平板式电泳槽垂直板式电泳槽二、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。

1.原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED

催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）

引发剂:光

TEMED的存在，可加速聚合。.聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成

凝胶的机械强度、弹性和透明度粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。

T=

C=

凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。

Acr与Bis的重量比应在30左右。

凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%样品分子量（Da）适宜的凝胶浓度（％）蛋白质<1041～4×1044×104～1×105105～5×105>5×10520～3015～2010～155～102～5聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表2.分离效应

PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应

连续PAGE1）电荷效应:

分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：

1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。

3.在电场中形成不连续的电位梯度。因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。8.38.38.96.7聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品缓冲液pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3

三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS－PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）的一种最好的办法。

SDSseparatesproteinsbyMW1.原理：

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。

SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。

两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。2.操作：（SDS及PAGE，即变性及非变性）1）制胶:

（变性：buffer中加0.4%SDS）

a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：

Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。

b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。2）样品制备：

a.PAGE:样品＋样品缓冲液[蔗糖或甘油（增加比重）＋指示剂溴酚蓝]b.SDS:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min，以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳：

SDS:电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。4）固定及染色a.固定：将凝胶浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白质组分。b.染色：

考马斯亮蓝染色法

银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂（糖蛋白）。理想显色剂的7S

安全（safety）：

灵敏（sensitivity）：

简单（simplicity）：

特异性（specificity）：

快速（speed）：

稳定（stability）：

兼容性（synergy）：四、等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续

pI的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。1.原理

两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保持稳定的pH梯度。(2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。(3)分子量小——电泳后易分离除去。(4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。等电聚焦电泳2.操作：

1）凝胶配制：凝胶浓度T为5％~7.5％（C=3%

左右）

2）加样：任意位置

3）电泳：