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文档简介
RNA的生物合成RNABiosynthesis(Transcription)1转录(transcription)是生物体以DNA为模板合成RNA的过程。转录RNADNA
转录产物除mRNA、rRNA和tRNA以外,在真核细胞内还有snRNA、miRNA等非编码RNA。2模板链:从3`到5`;合成的产物:5`到3`,反向平行,碱基配对。这两个原则在核酸合成中始终要遵守的。
转录本质:DNA的脱氧核苷酸顺序转抄成RNA的核苷酸顺序。
MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA3其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的,随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)通过碱基互补配对的方式识别目的mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解目的mRNA或者阻止目的mRNA的翻译。AlexanderMS,CasarJC,MotohashiN,VieiraNM,EisenbergI,MarshallJL,GasperiniMJ,LekA,MyersJA,EstrellaEA,KangPB,ShapiroF,RahimovF,KawaharaG,WidrickJJ,KunkelLM.MicroRNA-486-dependentmodulationofDOCK3/PTEN/AKTsignalingpathwaysimprovesmusculardystrophy-associatedsymptoms.JClinInvest.2014Jun2;124(6):2651-67.LiuN,Bassel-DubyR.RegulationofSkeletalMuscleDevelopmentandDiseasebymicroRNAs.ResultsProblCellDiffer.2015;56:165-90.GuoC,DengY,LiuJ,QianL.
Cardiomyocyte-specificroleofmiR-24inpromotingcellsurvival.
JCellMolMed.2014.SkommerJ,RanaI,MarquesFZ,ZhuW,DuZ,CharcharFJ.Smallmolecules,bigeffects:theroleofmicroRNAsinregulationofcardiomyocytedeath.CellDeathDis.2014Jul17;5:e1325.研究表明miRNA参与发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等4细胞内有小核RNA(smallnuclearRNA,snRNA)5snRNA是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spliceosome)的主要成分。参与mRNA前体的加工过程。其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸,共分为7类,由于含U丰富,故编号为U1~U7。在生物界,RNA合成有两种方式
一是DNA指导的RNA合成,叫转录,此为生物体内的主要合成方式,也是本章介绍的主要内容。另一种是RNA指导的RNA合成(RNA-dependentRNAsynthesis),叫RNA复制(RNAreplication),RNA复制催化的是RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase),常见于病毒,是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式。
6
复制DNA
转录
RNA
翻译
蛋白质
复制中心法则:复制和转录的区别7参与转录的物质:原料:
NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)
(人和动物体内的四种直接供能物质。ATP用的最多)模板:
DNA酶:
RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子及Mg2+和Mn2+等合成方向5
→3
,ATP:一个腺嘌吟,一个核糖,三个磷酸UTP:一个尿嘧啶,一个核糖,三个磷酸GTP:一个鸟嘌吟,一个核糖,三个磷酸CTP:一个胞嘧啶,一个核糖,三个磷酸每个分子去掉二个磷酸后是构成RNA的基本单位8RNA核糖核酸(缩写为RNA,即RibonucleicAcid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种,即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶,其中,U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。9原核生物转录的模板和酶Templates&Enzymesinprokaryotictranscription10一、原核生物转录的模板DNA分子上转录出RNA的区段,称为结构基因(structuralgene)。这些结构基因在DNA分子中占少数,而对细胞生物学功能起非常重要的作用。转录的这种选择性称为不对称转录(asymmetrictranscription),它有两方面含义:在DNA分子双链上,一股链用作模板指引转录,另一股链不转录;其二是模板链并非总是在同一单链上。5
3
3
5
模板链编码链编码链模板链115′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C编码链模板链mRNA蛋白质转录翻译DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链,称为模板链(templatestrand),也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand),也称为反义链或Crick链。12
1962年获得诺贝尔生理学医学奖135
3
3
5
模板链编码链编码链模板链结构基因转录方向转录方向不对称转录DNA分子上转录出RNA的区段,称为结构基因。转录对DNA链是有选择性的,并不是所有的DNA链都可以转录的。不对称转录的含义:在DNA分子双链上,一股链用作模板指引转录,另一股链不转录;其二是模板链并非总是在同一单链上。14二、RNA聚合酶催化RNA合成(一)RNA聚合酶能直接启动RNA链的合成DNA依赖的RNA聚合酶催化合成RNA;RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似。(NMP)n+NTP→(NMP)n+1+PPiRNA延长的RNA15RNA聚合酶的特点DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在,而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。RNA聚合酶和双链DNA结合时活性最高,但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板。
RNA聚合酶自身不能发现DNA的特殊序列——启动子(promoter)并与之结合,要与装配因子和一个定位因子结合后才能定位启动子序列,并指导按正确方向转录。三种RNA聚合酶均有其对应的启动子和终止子。16(二)RNA聚合酶由多个亚基组成17
大多数大肠杆菌RNA聚合酶是由4种5个亚基(a2bbs)组成的五聚体蛋白质,其中b亚基可以接受利福平或利福霉素抑制。核心酶
(coreenzyme)全酶
(holoenzyme)
转录起始阶段转录延长阶段α2ββ‘称为核心酶,转录延长只需核心酶;α2ββ'σ称为全酶,转录起始前需要σ亚基辨认起始点,所以全酶是转录起始必需的。18核心酶试管内的核心酶就能催化RNA的合成-试管内含有模板,酶,底物,NTP但是没有固定的起始点,也不能区分双联
DNA的模板链与编码链活的细胞转录开始需要全酶-但转录进行足长阶段仅需要核心酶核心酶中
和
亚基参与和DNA链的结合19亚基能识别模板上的模板链和启动子,保证转录从固定的正确位置开始。在转录延长时(首个磷酸二酯键形成后)脱落,可以反复使用,所以与转录延长无关。
大肠杆菌内有一些不同的RNApol全酶,其差异是σ亚基的不同。目前已发现多种σ亚基,并用其分子量命名区别,最常见的是σ70(分子量70kDa)。σ70是辨认典型转录起始点的蛋白质,大肠杆菌中的绝大多数启动子可被含有σ70因子的全酶所识别并激活。但有些基因的启动子,如热激蛋白(heatshockproteins,Hsp)也为另外的σ亚基(σ32)识别。20三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录转录是不连续、分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位,称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。5
3
3
5
结构基因调控序列RNA-pol21调控序列中的启动子是RNA聚合酶结合模板DNA的部位,也是控制转录的关键部位。原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录,其中由σ亚基辨认启动子,其他亚基相互配合。对启动子的研究,常采用一种巧妙的方法即RNA聚合酶保护法。22RNA聚合酶保护法23开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205
3
3
5
RNA-pol辨认位点(recognitionsite)5
5
RNA聚合酶保护区结构基因3
3
RNA聚合酶保护法研究转录起始区2425开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205
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RNA-pol辨认位点(recognitionsite)5
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RNA聚合酶保护区结构基因3
3
RNA聚合酶保护法研究转录起始区2627RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合原核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninProkaryote29原核生物的转录过程可分为转录起始、转录延长和转录终止三个阶段。
30RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开,使其中的一条链作为转录的模板。一、转录起始需要RNA聚合酶全酶转录起始需解决两个问题:312.DNA双链局部打开,形成开放转录复合体(opentranscriptioncomplex)
;DNA分子接近-10区域的部分双螺旋解开后转录开始。
DNA双链解开的范围只在17bp左右,这比复制中形成的复制叉小得多。1.
RNA聚合酶全酶(2)识别并结合启动子,形成闭合转录复合体(closedtranscriptioncomple);3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应,形成第一个磷酸二酯键:RNApol(
2
)-DNA-pppGpN-OH3
转录起始复合物:开链的DNA模板以及合成的一个
磷酸二酯键的核苷酸二聚体5
-pppG-OH+
NTP
5
-pppGpN
-OH3
+ppi转录起始过程:32第一个磷酸二酯键生成后,转录复合体的构象发生改变,σ亚基即从转录起始复合物上脱落,核心酶连同四磷酸二核苷酸,继续结合于DNA模板上,酶沿DNA链前移,进入延长阶段。RNA聚合酶各亚基比例:a:b:b
`
:σ=4000:2000:2000:60033E.coli的转录起始和延长RNA聚合酶全酶识别并结合启动子,形成闭合转录复合体DNA双链打开,形成开放转录复合体(opentranscriptioncomplex)在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应,形成第一个磷酸二酯键34转录过程中DNA的超螺旋结构变化转录过程中DNA的超螺旋结构变化35大肠杆菌的转录空泡局部结构示意转录空泡(transcriptionbubble):RNA-pol(核心酶)
····DNA
····RNARNA-poly(核心酶),DNA-RNA形成的复合物
RNA聚合酶覆盖的DNA长度大于40bp转录解链范围约17bp杂化双链长度约12bp
NMP逐个加入遇到模板为A时加入的是U不是T。RNA-pol向下游移时RNA分子的机构仍然保留。36三、原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行5
3
DNA核糖体RNARNA聚合酶在同一DNA模板上,有多个转录同时在进行;转录尚未完成,翻译已在进行。37依赖
因子的转录终止非依赖
因子的转录终止四、原核生物转录终止分为依赖
因子与非依赖
因子两大类转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进,转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。依据是否需要蛋白质因子的参与,原核生物转录终止分为:38
因子的作用原理:39目前认为,
因子终止转录的作用是:与RNA转录产物结合,结合后
因子和RNA聚合酶都可发生结构变化,从而使RNA聚合酶停顿,解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂化双链拆离,利于产物从转录复合物中释放。4041(二)非依赖
因子的转录终止DNA模板上靠近终止处,有些特殊的碱基序列,转录出RNA后,RNA产物形成特殊的结构来终止转录。这特殊的结构可起到
因子相似的作用,使转录复合物解体。42茎环结构使转录终止的机制使RNA聚合酶变构,转录停顿;局部RNA/DNA杂化短链的碱基配对是最不稳定的。RNA链上的多聚U也是促使RNA链从模板上脱落的重要因素。4344真核生物RNA的生物合成TheBiosynthesisofEukaryoteRNA45真核生物的转录过程比原核复杂。二者的转录起始过程有较大区别,转录终止也不相同。46一、真核生物有三种DNA依赖的RNA聚合酶真核生物具有3种不同的RNA聚合酶:RNA聚合酶Ⅰ(RNAPolⅠ)RNA聚合酶Ⅱ(RNAPolⅡ)RNA聚合酶Ⅲ(RNAPolⅢ)47真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂,所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基.RNApolⅡ在核内转录生成核不均一RNA(hnRNA),然后加工成mRNA并输送给胞质的蛋白质合成体系。mRNA是各种RNA中寿命最短、最不稳定的,需经常重新合成。RNApolⅡ还催化合成一些具有重要的基因表达调节作用的非编码RNA,如长链非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)和piRNA(与Piwi蛋白相作用的RNA)的合成。48RNA聚合酶Ⅱ由12个亚基组成,其最大的亚基称为RBP1。RNA聚合酶Ⅱ最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensussequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段,称为羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD)。CTD对于维持细胞的活性是必需的。RNApolⅡ是真核生物中最活跃、最重要的酶,故本章叙述的真核生物的转录主要以RNApolⅡ所催化的转录反应为例。49真核生物的RNA聚
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