维生素A和维生素E的测定方法和维C泡腾片配方工艺

维生素A和维生素E的测定方法（HPLC）

高效液相色谱法最小检出量分别为VA：0.8ng；α-E：91.8ng；γ-E：36.6ng；δ-E：20.6ng。

1.原理

食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后，将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用HPLC法测定维生素A及维生素E的含量。

2.适用范围

GB12388-90本法适用于各种食物和饲料的测定

3.仪器

（1）高压液相色谱仪（带紫外检测器）

（2）六孔恒温水浴锅

（3）旋转蒸发器

（4）高纯氮气

（5）高速离心机

4.试剂

本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水

4.1无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质

检查方法：取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。

脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸出的50ml。当乙醇中：

4.210%抗坏血酸溶液（Vc）W/V临用前配制

4.350%氢氧化钾溶液（KOH）W/V

4.4无水乙醚重蒸，不含过氧化物

4.4.1过氧化物检查方法：用5ml乙醚加1ml10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。

4.4.2去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。

4.5pH1-14试纸

4.6无水硫酸钠Na2SO4

4.7甲醇色谱纯或分析纯重蒸后使用

4.8重蒸水蒸馏水中加入少量高锰酸钾重蒸后使用

4.9苯并〔e〕芘标准液称取苯并〔e〕芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成1ml相当于5μg苯并〔e〕芘的内标溶液。

4.10维生素A标准液视黄醇（纯度85%Sigma公司）用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。维生素E标准液α-生育酚（纯度95%Sigma公司），δ-生育酚（纯度95%Sigma公司），δ-生育酚（纯度95%Sigma公司）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。

5.操作步骤

本实验需避光操作

(1)样品皂化称取样品于三角瓶中，加30ml无水乙醇，振摇三角瓶，使样品分散均匀。加入5ml10%抗坏血酸和苯并〔e〕芘标准液2ml，混匀。最后加入10ml氢氧化钾边加边振摇。于沸水浴上回流30min使样品皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。

(2)样品萃取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50ml水分2次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100ml无水乙醚分两次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。然后每次用约100ml水将乙醚液洗至中性，约4-5次。

(3)浓缩将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g）滤入150ml旋转蒸发瓶内，用约15ml乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下约2ml时，取下蒸发瓶，立即用氮气将乙醚吹干。加入2ml乙醇溶液，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上以3000转/min离心5分钟。上清液供色谱分析。

(4)标准曲线的制备将维生素A和维生素E标准品配置成标准溶液（约1mg/ml），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。标准浓度的标定方法取维生素A和维生素E标准液若干微升，分别稀释至10.00ml乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。测定条件如下

标准比吸光系数E1%cm波长λ，nm

视黄醇1835325

α—生育酚71294

γ—生育酚92.8298

δ—生育酚91.2298

浓度计算：

X1=A/E×1/100×10.00/S×10-3

式中X1：某维生素浓度，mg/ml；

A：维生素的平均紫外吸光值；

S：加入标准的量，μL；

E：某种维生素1%比吸光系数；

10.00/S×10-3：标准液稀释倍数。

本法采用内标两点法进行定量。把一定量的维生素A、维生素E及内标苯并〔e〕芘液混合均匀，选择合适的灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程的70%，作为高浓度点，高浓度的1/2为低浓度点（内标苯并〔e〕芘的浓度值不变），用此二种浓度的混合标准进行色谱分析。根据微处理机装置，按说明用二点内标法进行定量。

液相色谱分析

仪器所需条件

预柱：ODS10μm，4mm×4.5cm。

分析柱：ODS5μm，4.6mm×25cm。

流动相：甲醇：水=98：2。混匀，临用前脱气。

紫外检测器波长：300nm。量程0.02。

进样量：20μL进样定量环。

流速：1.65-1.70mL/min。

6.计算

X=C/m×V×100/1000

X：某种维生素的含量，mg/100g；

C：由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL；

V：样品浓缩定容体积，mL；

m：样品质量，g；

用微处理机二点内标法进行计算时，按计算公式计算或由微机直

接给出结果。

7.注意事项

（1）维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。

（2）在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。

（3）提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。

（4）洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。

（5）无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。

（6）在旋转蒸发时，乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量有损失。

（7）用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。维C泡腾片生产制作的要求和配方工艺一、维C泡腾片生产车间环境控制泡腾片在制粒、压片过程中对生产车间的湿度、温度要求非常严格也非常重要，一般要求相对湿度在30%以下（建议20％～25％）、温度在25度以下（建议温度15～21度）。建议打开空调和除湿系统，生产过程中必须严格防止水分的吸收，颗粒（如果制粒）与压片车间要控制空气的温湿度，降低相对湿度和控制温度。如果配方中一定要使用柠檬酸，生产车间的湿度和温度一定要控制在建议的湿度温度以内，否则很难做到不粘冲。柠檬酸工艺要求太苛刻，可改用酒石酸的，工艺要求会宽松些。润滑剂选用PEG6000：氯化钠为2：3的比例，效果也不错，酒石酸做酸源不容易吸湿，特别适合象重庆湿度较大的地区，而且崩解时限能完全符合规定，反应速度不亚于枸橼酸。只是酒石酸与钙镁离子相遇时，在水中会形成胶状沉淀。为达到溶液澄清的目的，用PEG-6000和氯化钠同时应用代替硬脂酸镁，溶液就能完全清澄。药检所在检验样品时用的是超纯水或蒸馏水，所以药检应该是能通过的。二、维C泡腾片标准配方VC－－25％柠檬酸－－11％碳酸氢钠－－35％羧甲基淀粉钠－－8％乳糖－－12％阿斯巴甜－－1.5％甜橙香精－－1％PVP-K30－－4％PEG6000－－1％微粉硅胶－－1％硬脂酸镁－－0.5％三、维C泡腾片配方润滑剂的选择泡腾片一般要求药物成分是可溶性的，为保持崩解后溶液澄明，应尽可能选用适宜的水溶性润滑剂。泡腾片压制生产过程中最容易出现的问题有：压片机粘模粘冲泡腾后有沉淀不清澄口感欠佳泡腾崩溶时限泡腾片出现色斑片重差异大压片机粘模粘冲除了泡腾片生产车间环境控制未达到要求外，也有泡腾片配方比例选择的原因。在使用压片机压片过程中大多是使用硬脂酸镁、滑石粉做润滑剂，但做维C泡腾片所有原料和辅料都必须是溶于水的，因为硬脂酸镁是疏水性物质，不容于水，在维C泡腾片中使用硬脂酸镁会产生混浊沉淀现象，建议不要用的或尽量少用。后来我们用PEG6000和微分硅胶两种润滑剂，微粉硅胶是助流剂，不是润滑剂。助流剂的机理是填充颗粒间的空隙、填平颗粒粗糙的表面，增加流动性；润滑的机理是降低片剂和压片机冲模具之间的摩擦力，也会出现有沉淀现象。润滑剂选用PEG较好，PEG6000的效果要好于PEG4000，建议用PEG6000，并增加氯化钠，用量与PEG6000为2：3，PEG6000的用量为5％左右。其次，微粉硅胶、酒石酸、碳酸氢钠，酒石酸与碳酸氢钠在一起是很容易粘冲的，可以考虑将碳酸氢钠用熔融的PEG包裹，冷却后干燥、粉碎，再与主药、酒石酸一起制粒，压片机粘冲现象也就大大减轻了。后来将柠檬酸换成酒石酸或富马酸后，效果较好无沉淀现象了。酒石酸代替柠檬酸，吸潮性会大大降低，但是口感就不如柠檬酸的好了。饮料里常加的矫味剂就知道了，用酒石酸的很少，那是因为口感不好。有些维C泡腾片生产厂家用硬脂富马酸钠，硬脂富马酸钠也是可溶的，但成本价格会高些。防粘模粘冲效果我们也比较过，基本上和硬脂酸镁差不多。据我们多年来的粉末成型经验，在大山楂泡腾片的生产工艺中，曾经指导过大山楂泡腾片生产厂家采用聚乙二醇的乙醇液同碳酸氢钠混合，经喷雾器形成细粉，聚乙二醇可将碳酸氢钠包裹，避免与酸直接接触，增加山楂泡腾片剂的稳定性，同时解决了压片时的粘冲问题。其实泡腾片中润滑剂的选择的确很头痛。NaCl在力度伸泡腾片的处方上并不是做润滑剂用的，而是做引湿剂！（只有用了它，才能在30秒内崩解），在一般泡腾片中做润滑剂效果不是很明显。L-亮氨酸效果不错，但价格偏高。使用时都必须过60目