疾病相关基因功能研究的方法与策略课件

疾病相关基因功能研究的方法与策略疾病相关基因简介12疾病相关基因的研究内容34研究方法与策略疾病相关基因的鉴定内

容

概

要5实例列举2疾病相关基因简介12疾病相关基因的研究内容34研究方法与策略疾病相关基因的鉴定内

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要5实例列举3目录疾病相关基因是医学分子生物学最重要的领域。几乎所有疾病都与基因结构或表达变化有关，是遗传因素和环境因素相互作用的结果。疾病相关基因致病基因：一种疾病的表型和一个基因型呈直接对应的因果关系，即该基因结构或表达的异常是导致该病发生的直接原因疾病易感基因：环境因素和遗传因素均起着一定作用，表现为2个以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因间的相互作用，而单一基因变异仅增加对疾病的易感性疾病相关基因疾病相关基因举例：人血红蛋白功能56正常红细胞镰刀（Sickle）形红细胞疾病相关基因N-val

·his

· leu·thr

·pro

· glu·glu

·····N-val

·his

· leu·thr·pro

· val·glu

·····镰刀形红细胞贫血病：GA

GGT

G7C(146)

HbAC(146)

HbS镰刀（Sickle）疾病相关基因分子病（molecular

disease）

：

Gene突变导致蛋白质分子质和量异常，从而引起机体功能障碍的一类疾病，称为分子病。

链第6位谷氨酸被缬氨酸取代，形成HbS（镰状Hb)。在缺氧情况下，HbS聚合形成长棒状聚合物，使红细胞镰变，变形能力低，导致溶血、贫血，引起血粘度增高，血管梗阻性继发症状。8疾病相关基因Nature16September2009doi:10.1038/news.2009.921Colourblindnesscorrectedbygene

therapy

Treatedmonkeyscannowseein

technicolour.疾病相关基因10疾病相关基因简介12疾病相关基因的研究内容34研究方法与策略疾病相关基因的鉴定内

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要5实例列举一、鉴定疾病相关基因的关键是确定疾病表型和基因间的实质联系目录正确的诊断是鉴定疾病基因的先决条件确定疾病的遗传因素，即通过孪生子分析，领养分析和同胞罹患率分析等确定遗传因素是否在疾病发病中的作用及其作用程度。（一）从已知蛋白质的功能和结构出发克隆疾病基因目录功能克隆（functional

cloning）采用的是从蛋白质到DNA的研究路线，针对的是一些对影响疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病。依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆疾病相关基因用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因（二）从疾病的表型差异出发发现疾病相关基因目录表型克隆（phenotype

cloning）基于对疾病表型和基因结构或基因表达的特征联系已经有所认识的基础上来分离鉴定疾病相关基因。比较患者基因组DNA与正常人基因组DNA的不同，直接对产生变异的DNA片段进行克隆，而不需要基因的染色体位置或基因产物的其他信息。（三）采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因目录人类的部分疾病，已经有相应的动物模型。如果动物某种表型的突变基因定位于染色体的某一部位,

而具有相似人类疾病表型的基因很有可能存在于人染色体的同源部位。另外，当疾病基因在动物模型上已完成鉴定，还可以采用荧光原位杂交来定位分离人的同源基因。荧光原位杂交技术(Fluorescence

insituhybridization,

FISH)检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析目录HER2人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER2)二.

鉴定疾病相关基因需要多学科多途径的综合策略目录疾病相关基因鉴定克隆策略示意图疾病相关基因的鉴定基因诊断*

(gene

diagnosis)

是以DNA或RNA为材料，检测基因结构和表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断的方法。基本过程:分离、扩增待测的DNA/RNA片断区分或鉴定DNA/RNA的异常目录目录20疾病相关基因简介12疾病相关基因的研究内容34研究方法与策略疾病相关基因的鉴定内

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要5实例列举基因的功能实际是基因产物的功能，即编码基因的蛋白质功能和非编码基因RNA的功能。目录基因产物之一蛋白质的功能可从三个不同水平来描述：①

生化水平，主要描述基因产物参与了何种生化过程，如属于激酶、转录因子等② 细胞水平, 主要论述基因产物在细胞内的定位和参与的生物学途径，例如，某蛋白质定位于核内，参与DNA的修复过程等③

整体水平,

主要包括基团表达的时空性及基因在疾病中的作用一、基因比对及功能诠释目录常用的两大双序列比对工具是BLAST

和FASTA,分别由美国国立生物技术信息中心（NCBI）和欧洲生物信息学研究所（EBI）开发和维护。NCBI的主页是/；EBI的主页是http://www.ebi.ac.uk/。二、利用工程细胞研究基因功能目录（一）采用基因重组技术建立基因高表达工程细胞系（二）基因沉默技术抑制特异基因的表达三、利用基因修饰动物整体研究基因功能目录尽管在体外对基因功能的研究可提供大量信息，但是只有在整体内的研究才能真实反映该基因在体内的真正作用。通过在实验动物，持别是小鼠体内进行相关的基因操作，获得基因修饰动物品系，已成为在体研究基因功能的重要手段，常用的有转基因动物和基因敲除动物。四、研究生物大分子间的相互作用可确定基因功能目录在一些情况下,

即使对基因的序列、结构和表达模式有清楚的认识，但仍然难以阐明基因所表达的蛋白质的功能。此时通过研究该蛋白质与已知功能蛋白质的相互作用，无疑将非常有助于对该蛋白质功能的了解。常用的高通量筛查蛋白质间相互作用的方法是酵母双杂交技术和噬菌体展示技术。FunctionalAnalysisof

Genes目录Sequenceandstructure

analysisExpression

profilingCellularcompartmentalizationGain-of-functionLoss-of-functionProtein-protein

interactionUpstream

cuesDownstream

effects疾病相关基因简介12疾病相关基因的研究内容34研究方法与策略疾病相关基因的鉴定内

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要527实例列举疾病研究历程28疾病相关基因研究策略“我有一个Topic，你能帮我

Make

Story吗？”29疾病相关基因研究背景—— 想做什么，能不能做，如何去做30数据集成的哲学基础“我们所观测到的不是自然本身，而是自然根据我们探索它的方法的展现”——维尔纳·海森堡

(“测不准原理”,

量子力学，1932年诺贝尔物理学奖)31数据集成的哲学基础“我们所观测到的不是自然本身，而是自然根据我们探索它的方法的展现”——维尔纳·海森堡

(“测不准原理”,

量子力学，1932年诺贝尔物理学奖)32多维组学数据整合的案例TCGA(The

Cancer

GenomeAtlas,

NIH),涉及到6个层次的组学数据33以TCGA数据集成为例••集成了多达7种组学数据（如SNPs,

Copy

number,

DNA

methylation,Geneexpression,microRNAsexpression

etc.)各种组学数据均可与临床预后信息建立相关性将各种组学变化映射到pathway或基因网络集成基因拷贝数、基因表达谱，发现癌症的驱动因素（driver

genes）Step

1:

选定某个疾病领域中特定topic，如”我是做肾癌的，最近关注microRNAs，考虑从

autophagy（自噬）角度做点东西”Step2:

通过系统集成

的

TCGA

肾

癌中>200例病人的

mRNAs

+microRNAs

+

临床预后数据），利用Nature上发表的方法原理，预测出通过自噬autophagy影响癌症预后的microRNAs

及其靶基因Step

3:

通过细胞实验验证上述microRNAs对自噬的调控作用36“我有一个Topic，你能帮我

Make

Story吗？”疾病相关基因研究策略37检测指标分类1、细胞行为指标。(增殖、凋亡、侵袭迁移、电生理、分化等)2、分子指标。（

P53、EMT、Ki67等）

疾病相关基因研究策略—— 想做什么，能不能做，如何去做确定细胞模型及检测指标原则1、细胞及检测指标与研究的临床问题相符。2、课题组具有可操作性。方法1、查高分文献。2、请教该领域专家。38疾病相关基因研究策略—— 想做什么，能不能做，如何去做

确定动物模型及检测指标1、免疫缺陷鼠(

裸鼠、SCID)2、转基因小鼠3、基因敲除小鼠39肿瘤分子生物学常用实验动物Nude

Mouse，简称裸鼠NOD/SCID、beige

SCID(non-obesediabetic/servercombined

immunodeficiency)40临床科研课题研究内容A基因通过调控B信号通路影响C疾病的D功能临床相关性研究:

A--C组织水平：临床组织样本基因的表达情况临床深度：基因表达水平与各种临床特点（恶性程度，转移与否，耐药性，生存率等）的相关性功能研究:

A--D细胞水平：增殖，凋亡，转移，侵润，血管新生，耐药动物水平：成瘤，转移，药物敏感3.

机制研究:

A--B分子水平：相互结合，表达调控，翻译后修饰前，降解调控，剪切调控，胞内定位，激酶信号传导等41临床科研课题成功的判断标准A基因需具备三个性质：1、创新性在所研究的临床问题中首次报道。Gene

and

disease

到PubMed查询。有和无。有功能的新基因（狭义）：临床单位研究目标。调控蛋白编码基因的广义“基因”，microRNA，

lncRNA，表观遗传学：科学院所研究目标。2、临床相关性在临床样品上存在差异。表达差异、突变、修饰等3、功能在细胞及动物上，具备功能，且功能与临床问题一致。科研课题提升的路径机制研究三个大类：1、分子相关性上下游信号通路检测。

A基因改变后，下游信号通路B如何改变。2、功能相关性a、A干扰后，B下降，细胞有功能表型。那么单独把B干扰，功能表型是否跟A干扰一致。b、A干扰后，B下降，细胞有功能表型。那么在A干扰的前提下，把B过表达，看细胞表型是否恢复。3、直接互作Yeast

two

hybridization、GST

pull-down、Co-IP、EMSA、ChIP。42临床科研课题做好需要的四个元素发现创新的功能基因临床相关性基因功能机制探索43如何寻找一个功能基因A文献调研基因芯片功能基因A移植研究创新度差不一定成功44蛋白质芯片蛋白质芯片(protein

chip)*是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。蛋白质芯片作用原理蛋白质分子间的亲和反应47~30000个基因表达谱芯片数百~数千个表达差异个基因芯片下游的工作简单数据分析数十到数百个

基因常规生物信息学分析（大

部分芯片

服务公司

能提供的

服务）找不到新基因，更找不到新功能基因20~30个基因功能基因（10%）功能学验证个性化的生物信息学与文献分析目录FunctionalAnalysisof

GenesSequenceandstructure

analysisExpression

profilingCellularcompartmentalizationGain-of-functionLoss-of-functionProtein-protein

interactionUpstream

cuesDownstream

effects临床科研课题做好需要的四个元素发现创新的功能基因临床相关性基因功能机制探索49机制探

索机制研究三个大类：1、分子相关性上下游信号通路检测。

A基因改变后，下游信号通路B如何改变。2、功能相关性a、A干扰后，B下降，细胞有功能表型。那么单独把B干扰，功能表型是否跟A干扰一致。b、A干扰后，B下降，细胞有功能表型。那么在A干扰的前提下，把B过表达，看细胞表型是否恢复。3、直接互作Yeast

two

hybridization、GST

pull-down、Co-IP、EMSA、ChIP。50一、蛋白质与蛋白质