咖啡对糖尿病大鼠胰岛素敏感性、氧化应激指标及胰腺内胰岛素含量的影响

咖啡对糖尿病大鼠胰岛素敏感性、氧化应激指标及胰腺内胰岛素含量的影响

糖尿病严重威胁人类健康，饮食习惯和生活方式与糖代谢紊乱的发生和发展密切相关。最近国外多中心的流行病学研究显示,长期饮用咖啡能降低2型糖尿病的发病率,而且发病率与每日饮用咖啡的量呈负相关。本研究分别以咖啡和去咖啡因咖啡灌胃大鼠后,观察高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠糖调节状态和血浆氧化应激指标及胰腺内胰岛素含量,评估咖啡对糖尿病大鼠氧化应激状态和胰岛素敏感性和内源性胰岛素分泌的影响。1材料表面1.1实验动物及其饲养条件清洁级健康雄性Wistar大鼠48只,平均体重215g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,合格证号:SCXK(沪)2008/0016,在室温为18~25℃,相对湿度50%~80%条件下饲养。1.2灌胃用具体糖与咖啡成分的关系高脂饲料(热量百分比:18%猪油、8%蛋黄粉、2%胆固醇、0.2%胆盐和71.8%普通基础饲料,上海斯莱克实验动物有限公司);STZ(美国Sigma公司,纯度:99.89%);灌胃用含咖啡因咖啡和去咖啡因速溶咖啡(云南云潞食品公司,经高效液相质谱分析检测,含咖啡因咖啡咖啡因含量26mg·g-1,去咖啡因咖啡咖啡因含量<1mg·g-1);胰腺内胰岛素含量以放射免疫法检测,双抗体夹心ELISA法测血浆8-OHDG和血浆8-isoPGF2α水平,以上放射性免疫试剂盒及ELISA试剂盒均购自上海杰飞生物科技有限公司。2方法2.1各组的分组。对于有机溶剂不同的组织,每模型组有7个月随机取12只Wistar大鼠为正常对照组(NC组),其余36只分为3组,每组12只,各为咖啡灌胃组(CC组)、去咖啡因咖啡灌胃组(DC组)、STZ对照组(S组)。2.2gd-1的处理NC组予以常规饲养,CC组、DC组、S组予高脂饲料,4组大鼠自由进食进水。CC组予含咖啡因咖啡0.5g·d-1,DC组予去咖啡因速溶咖啡0.5g·d-1,以6mL生理盐水溶解,每日灌胃2次。S组以同等量生理盐水每日灌胃2次。大鼠连续灌胃8周,隔夜空腹>10h,CC组、DC组、S组大鼠予以STZ10mg·kg-1腹腔注射(STZ以pH=4.4的0.1mol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释)。2.3空腹血糖及灌胃后20、60、126min大鼠STZ腹腔注射后1周,予隔夜禁食>10h,称重,行OGTT,葡萄糖2.2g·kg-1溶于4mL蒸馏水灌胃,记录大鼠空腹血糖及灌胃后30、60、120min血糖。行OGTT后第2日,再次予隔夜禁食10h,称重,行ITT,颈后皮下注射胰岛素(诺和林R,丹麦诺和诺德公司)0.5U/(kg·只),即刻予葡萄糖2.2g·kg-1,记录胰岛素注射后15、30、60、120min血糖值,计算各时间点血糖相对于注射前血糖下降比率Δ%[(胰岛素注射前血糖-ITT观察点血糖值)/注射前血糖)]。2.4胰腺内胰岛素水平大鼠腹腔注射2%戊巴比妥麻醉,腹主动脉取血,2500r·min-1离心10min,分离血浆,双抗体夹心法ELISA测血浆8-OHDG和血浆8-isoPGF2α水平。酸乙醇提取法提取胰腺内胰岛素,取大鼠胰腺组织,-70℃液氮速冻,溶解于pH2.5~3.0的0.4%草酸和70%乙醇混合液中。温度10~15℃下搅拌提取。离心后再次以酸乙醇液提取,合并2次浸出液。放射免疫法检测胰腺内免疫反应性胰岛素(IRI)含量。2.5间均数的比较所有计量资料以均数±标准差表示,以SPSS13.0统计软件进行统计分析。组间均数比较采用方差分析。各组间均数两两比较采用S-N-K检验,以P<0.05为差异有统计学意义。以胰腺内胰岛素水平为应变量,ITT血糖下降比例、8-OHDG、8-isoPGF2α进入多元回归,分析以上指标与胰腺内胰岛素的相关性。3结果3.14高脂饮食联合小剂量stz诱导糖尿病大鼠模型评价结果OGTT结果显示,CC组、DC组和S组大鼠空腹血糖及OGTT30、60、120min血糖均明显高于NC组大鼠(P<0.05),说明高脂饮食联合小剂量STZ诱导糖尿病大鼠模型成功(见表1)。3.24cc组与dc组2种外包剂2、10、100min%与S组比较,DC组和CC组ITT30、60、120min血糖下降比例(Δ%)明显增加,与NC组比较,CC组和DC组30、60、120minΔ%无显著差异。提示糖尿病大鼠较正常对照大鼠存在外周胰岛素利用障碍,咖啡和去咖啡因咖啡灌胃均有可能提高本实验中糖尿病大鼠外源性胰岛素利用(见表2)。3.34cc对8-isopgf2和8-ohdg水平的影响CC组、DC组、S组血浆8-isoPGF2α和8-OHDG水平均较NC组明显升高,CC组和DC组8-isoPGF2α和8-OHDG水平显著低于S组。CC组和DC组间比较无显著差异。该结果提示糖尿病大鼠氧化应激标志物明显高于正常对照组,但咖啡和去咖啡因咖啡咖啡灌胃均有可能改善糖尿病大鼠体内氧化应激状态,两者对体内氧化应激标志物影响无明显差异(见表3)。3.44咖啡灌胃对糖尿病大鼠胰腺内源性胰岛素水平的影响与NC组比较,CC组、DC组、S组胰腺内平均胰岛素含量显著降低,CC组平均胰腺内胰岛素水平明显高于DC组和S组,提示本实验中糖尿病大鼠内源性胰岛素分泌不足,咖啡灌胃可增加糖尿病大鼠胰腺内胰岛素分泌,而去咖啡因咖啡则无此作用(见表3)。3.5相关分析相关分析显示胰腺内胰岛素含量与血浆8-isoPGF2α显著负相关(B=-2.036,P=0.007)。4高血压大鼠糖尿病外源性胰岛素利用机制近年来,糖尿病患者的饮食结构日益受到关注,越来越多医务工作者关注于如何调节患者日常饮食以控制血糖同时避免膳食过度单一化。咖啡是目前全球消耗量最大的来源于天然植物的饮料。既往曾经认为咖啡中主要成分咖啡因可刺激垂体-肾上腺皮质轴,引起促肾上腺皮质激素和皮质醇合成增加、降低胰岛素的敏感性,因而建议糖尿病易感人群应尽量减少富含咖啡因饮料的摄入。然而,对1.6万名芬兰人进行长期的跟踪发现每日喝咖啡3~4杯的女性,糖尿病发病率降低29%;每日喝咖啡>10杯的女性,糖尿病发病率降低79%。在男性中,这2个数字分别为27%和55%。该结果被列入美国《时代》周刊2006年医学新发现。据统计,目前全球共有10余项多中心临床研究和2项meta分析支持长期适量饮用咖啡可降低2型糖尿病的发生风险,且咖啡降低糖尿病发生率趋势无关种族、人群、和地区分布。目前,关于咖啡调节糖代谢机制的实验室研究进行较少,长期饮用咖啡降低2型糖尿病发生的具体机制尚不明确。STZ选择性破坏胰岛B细胞,大剂量注射可制造接近1型糖尿病动物模型。由于2型糖尿病兼有胰岛素抵抗和B细胞功能障碍特点,本研究以高脂饮食联合小剂量STZ制作糖尿病模型,OGTT各观察时间点血糖明显升高,ITT提示机体胰岛素利用障碍和胰岛素抵抗,胰腺内胰岛素含量明显低于正常对照组,造模过程中未出现动物死亡,说明造模成功,高脂饮食联合小剂量STZ可获得较稳定的合并外周胰岛素抵抗的糖尿病大鼠模型。本研究ITT结果,DC组和CC组30、60、120min血糖下降比例(Δ%)明显高于S组,且与NC组比较Δ%无显著差异,提示咖啡和去咖啡因咖啡均可提高糖尿病大鼠外源性胰岛素利用。近年临床研究报道,2型糖尿病发生率随日常饮品中咖啡因摄入量而下降,亦有报道长期饮用含咖啡因或去咖啡因咖啡均能显著降低2型糖尿病的发生率,提示咖啡中主要成分咖啡因和其他生物活性物质都可能参与调节葡萄糖代谢,与本研究结果相符。目前已证实咖啡中氯原酸能减少葡萄糖的吸收、抑制肝糖原的水解、增加胰岛素敏感性,葫芦巴碱和镁离子有助于增强胰岛素的分泌及敏感性。尽管部分研究发现短期给予较大剂量咖啡因可损害机体胰岛素敏感性,加重胰岛素抵抗,但有学者认为,长期饮用咖啡可使得机体逐渐产生耐受,降低远期糖尿病发生率与饮料中摄入咖啡因量相关。有研究报道短期给予酚醛类化合物可拮抗咖啡因对糖代谢的短期不利影响,可能与去咖啡因咖啡降低糖尿病发生率相关。氧化应激被认为是高血糖对胰岛B细胞毒性作用的主要机制之一。STZ破坏胰岛B细胞主要机制是通过诱导NO合成增加对B细胞的氧化侵袭,与糖尿病氧化应激损伤B细胞类似。B细胞DNA链上的碱基鸟嘌呤C-8位受羟自由基及单线态氧的攻击发生羟化生成8-OHDG,是DNA氧化损伤的特异及主要的产物,亦是公认的内源及外源性因素对DNA氧化损伤的生物标志物。8-isoPGF2α是具生物活性的拟前列腺素样物质,是脂质过氧化的终末产物,特异反映组织氧化应激水平。本研究结果显示CC组、DC组和S组腹腔注射STZ后,血浆8-isoPGF2α和8-OHDG水平较正常对照组明显升高,提示高脂饮食联合小剂量STZ诱发大鼠体内氧化应激增强,导致氧化损伤。咖啡中咖啡因、酚醛类化合物、类黑素等多种生物活性成分均有抗氧化作用,体外实验证实咖啡具有较强的抗氧化能力,咖啡中亚麻木脂素组分可通过减少氧化应激降低注射STZ的大鼠糖尿病发生率。本实验观察到CC组和DC组注射STZ后血浆8-isoPGF2α和8-OHDG水平低于S组,支持含咖啡因咖啡或去咖啡因咖啡均可影响氧化应激,减轻机体氧化损伤。作为分泌胰岛素的主要细胞,胰岛B细胞分泌胰岛素过程与细胞内电兴奋有关。咖啡因是细胞内ryanodine钙库受体激动剂,可能通过引发对ryanodine敏感的钙库释放,促使胰岛素分泌。由于本实验中大鼠ITT需注射外源性胰岛素,检测血清胰岛素水平难以准确评估大鼠自身胰岛分泌功能,胰腺内胰岛素含量测定较外周血胰岛素水平更直接准确反映B细胞分泌功能。本研究结果显示CC组、DC组、S组经STZ注射后胰腺内胰岛素较正常对照组显著下降,然而,CC组胰腺内胰岛素含量高于DC组和S组,提示咖啡因可促进内源性胰岛分泌,可能对维持正常B细胞功能具潜在作用。回归分析统计结果显示,胰腺内胰岛素水平与8-isoPGF2α显著负相关,提示B细胞胰岛素分泌功能障碍可能是氧化应激的直接或间接结果,减轻机体氧化应激状态有助于B细胞功能保护。本研究以高脂饮食联合小剂量STZ诱导2型糖尿病大鼠模型,同时以含咖啡因咖啡和去咖啡因咖啡干预,结果显示两者均可能增加胰岛素敏感性、