杉木组织培养快速繁殖技术研究

杉木组织培养快速繁殖技术研究

楠木又名红景天，是马鞭草科的一种植物。柚木原产印度、缅甸、泰国和印度尼西亚等地,是东南亚地区的主要造林树种［1］。柚木兼具生长迅速、纹理美观、耐腐抗虫和易于加工等优良特性,在国际上被誉为最重要的热带用材树种之一［2］。主要用于制造军舰和海轮,为军需和航海的重要物资,也是建码头、桥梁、建筑、车箱、家具、雕刻、木器和贴面板、镶贴板的高级用材［3］。在我国,随着人们生活水平不断提高,对天然实木产品的追求不断增强,柚木作为名贵优质的实木原料逐渐受到人们的喜爱。我国无柚木天然林分布,人工林多为20世纪60年代营造,且大多数已砍伐,目前保存的人工林多为萌芽更新的幼林。而缅甸是目前仅有的柚木原木出口国,我国每年的进口的原木远远满足不了国内市场的需求,年缺口达50%以上。针对目前我国柚木原木供需的巨大矛盾,人工规模化培植柚木人工原料林是解决这一问题的最有效途径。发展柚木人工原料林种苗是关键。传统的柚木种苗繁殖主要以种子繁殖为主,但柚木种子萌发的周期长,效率低,并且柚木母树林和无性系种子园的种子产量也很有限［4］,柚木种苗数量无法满足规模化造林的需求。采用组培快繁技术,可在短期内获得大量优良无性系试管苗［5］,是解决柚木种苗需求的有效途径。1试验材料和方法1.1试验材料以广西林业科学研究院珍贵乡土阔叶树种苗圃中培育的柚木3年生优良无性系植株基部的萌条茎段作为外植体。1.2测试方法1.2.1外植体的处理取15~20cm健壮半木质化枝条,将采回的枝条去除叶片后,用清水将附着枝条表面的泥土等污染物清洗干净,再用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗,后用去离子水清洗1~3次,冲洗后将枝条剪切成带1~2个腋芽、长约1.5~2.0cm的茎段,无菌条件下用75%乙醇浸泡30s,无菌水清洗2次。外植体用2种方法处理,每种方法分别设3个不同的灭菌时间:(1)用0.1%HgCl2分别消毒6、8、10min,以振荡的方式进行灭菌处理,最后用无菌水冲洗6次。(2)用0.1%的HgCl2浸泡外植体2次,每次分别是3、4、5min,第1次HgCl2浸泡后用无菌水冲洗2次;然后倒入0.1%HgCl2浸泡,最后用无菌水冲洗6次,接种于培养基上。每处理30个外植体,培养基为MS附加细胞分裂素6-BA0.5mg/L。接种15天时统计外植体消毒效果。1.2.2入细胞分裂素测定选择MS、DKW和WPM,3种基本培养基,在3种基本培养基中都加入细胞分裂素6-BA1mg/L。每种基本培养基接种消毒好的无菌茎段30段,以肉眼观察到分化生长的芽时定为外植体始芽萌动,培养30天时进行统计。外植体始芽诱导率=芽诱导的外植体数/接种总数×100%。1.2.3培养基组合设计将初代培养中获得的无菌芽取下后转入增殖培养基中,选择MS为基本培养基添加不同浓度的6-BA和NAA来研究影响柚木丛生芽发生的最适培养基组合。其中6-BA的浓度分别0、0.5、1、2mg/L,NAA的浓度分别0、0.25mg/L,采取完全随机区组试验设计,设计7个处理,每处理每瓶接种单芽6颗,5次重复。培养25天时以能切割剥离且长大于0.2cm的单芽为计数标准,统计芽的增殖系数并记录增殖芽的生长状况。芽增殖系数=培养25天芽增殖总数/接种芽数。1.2.4培养基的选择当继代培养扩大到一定数量并生长到一定高度(3~4cm)时做生根培养试验。选择NAA、IBA和基本培养基为试验因素,试验用L9(34)正交表试验设计(表1),设计9个处理,每处理接种单芽6颗,5次重复。各处理外加1.5%蔗糖和3.5g/L琼脂。25天统计各处理的生根率。生根率=单芽生根株数/接种总数×100%。1.2.5脂、高温灭菌上述培养基内有特别说明外,其余均含3%蔗糖、琼脂3g/L,pH值为6.8,高温灭菌15~20min。培养室温度(25±2)℃,光照强度2000~5000lx。2结果与分析2.1不同消毒方法对高安全性细胞菌群的消毒效果,hgcl2消毒采用不同消毒方法对柚木茎段进行表面消毒处理。在6~10min的消毒时间内,0.1%升汞对外植体进行消毒随着时间越短,污染率越高(表2)。而消毒的时间延长虽然能降低污染率,无菌褐死数却增加,其原因是,HgCl2消毒时间过长会对组织细胞产生毒害杀伤茎段,无菌活体获得率反而下降。而用0.1%的HgCl2浸泡外植体2次的消毒方法,污染率和无菌褐死率的变化趋势与用0.1%的HgCl2浸泡外植体1次的消毒方法基本一致。在相同的0.1%HgCl2消毒时间内,用0.1%的HgCl22次的消毒方法优于1次的消毒方法,无菌活体的获得率更高。在0.1%HgCl2浸泡外植体2次的消毒方法中,先消毒4min,无菌水清洗后再消毒4min的处理无菌活体的获得率为30%,为各处理最佳。2.2外植体始芽多态性将外植体接种到3种培养基进行始芽的诱导培养,在培养10天后,各种培养基中的茎段的腋芽陆续开始萌动,同时茎基部处逐渐膨大,形成白色愈伤组织。在培养20天后,芽基部的愈伤组织不断增大,直径可达1.5cm以上。而腋芽也不断伸长,长度在2~3.5cm,腋芽基部周围产生数量不等的丛生芽(1~5个)。在培养30天后,芽基部愈伤组织停止增大,没发现愈伤组织诱导出不定芽。腋芽继续伸长生长,最长的芽可达5cm以上。从表3可以看出,基本培养基对外植体始芽萌动的影响差异较大。培养30天,MS的诱导率为各处理中最高,达86.7%,而且每个无菌活体茎段平均能诱导出4.7个小芽,也为各处理最高。在MS基本培养基中生长,芽叶色浓绿,生长健壮。3种基本培养基最不适合柚木生长的是DKW,在其生长的芽细长、叶色发白、长势较弱,平均每个茎段只能诱导出1.6个芽。2.3-ba对3种常用植物愈伤组织的影响激素对柚木不定芽增殖有很大的作用。在不加任何激素的培养基中,没有愈伤组织的形成,也不能诱导出丛芽,只有60%的无菌芽能诱导出单芽,但单芽生长25天后,下部叶子开始发黄,30天后叶子变褐死亡,芽纤细长势差。在添加了激素的培养基中,无论浓度是多少,芽的基部都会形成愈伤组织,且随着6-BA浓度的增大,愈伤组织的直径也随之增大,说明柚木是容易诱导愈伤组织的植物,但没见有不定芽从愈伤组织中分化出来。细胞分裂素6-BA对柚木不定芽增殖也有较大的影响,而生长素对柚木不定芽增殖却影响不大。在相同的6-BA浓度下,无论添加NAA与否,柚木组培芽的增殖系数变化不大,多重比较两者的差异不显著。柚木不定芽的增殖系数随着6-BA浓度的升高而增加,当6-BA浓度为mg/L,柚木不定芽的增殖系数最高,达到6.1以上,且丛生芽生长健壮。当6-BA浓度大于1mg/L时,柚木不定芽的增殖系数不但下降,而且丛芽的质量较差,并伴有轻度的玻璃化现象。2.4对技术路线的影响R值(极差)表示因素对指标影响的大小,即因素的重要性。极差越大,该因素的水平改变时对指标的影响越大。3个因素R值大小分别次序为:基本培养基>NAA>IBA;说明对柚木生根影响最大的因素为基本培养基,其次是NAA,影响因素最小是IBA(表5)。直观分析法也可得到各因素的较优水平,在基本培养基中以1/2MS为较优水平,而NAA浓度的较优水平为1.0mg/L,IBA的较优水平是2.0mg/L。在上述生根试验处理中,没有出现各因素的最优组合处理,但在次优水平的组合1/2MS+NAA1.0mg/L+IBA0.5mg/L的生根培养基中,柚木的生根率可达到90%,且根系质量较好,一般可以长3~4条根。如果柚木单芽在理论中最优的生根培养基1/2MS+NAA1.0mg/L+IBA2.0mg/L中诱导生根,其生根效果可能会更好,但其结果还需有待实验的进一步证实。3组培植物的生长特性(1)柚木茎段表明长满小毛,导致茎段的表面积大大增大,微生物大量附着其上,如果用0.1%HgCl2消毒时间过短,消毒不彻底易于长菌。但HgCl2具有较强的细胞渗透能力,外植体消毒时间过长,消毒液对组织细胞有明显的毒害作用,影响外植体存活。本研究用0.1%的HgCl2浸泡外植体,用无菌水清洗后再用0.1%的HgCl2浸泡的消毒效果较好,HgCl2对外植体的毒害减小,无菌体获得率有一定的提高。(2)基本培养基是植物组培苗生长的营养物质基础,各种无机离子的浓度比例直接影响到植物的生长。本研究表明,MS是柚木组培的较适基本培养基,柚木在其中生长,叶色浓绿、长势良好。细胞分裂素6-BA是柚木增殖培养最关键的激素,柚木增殖培养最适合的6-BA浓度为1mg/L,柚木不定芽的增殖系数可达6.1以上,且丛生芽生长健壮。在实验中还发现,只要加了6-BA的培养基,无论浓度是多少,柚木都会有愈伤组织的形成,说明柚木易于形成愈伤