分子技术在杉木遗传育种中的应用

分子技术在杉木遗传育种中的应用

楠木是马鞭草科的一种大型树木。它自然分布在巴基斯坦南926和东经7314的印度南部、中部、泰国北部、缅甸和老挝。它是世界上最著名的材料树种，被称为“万木之王”。心材呈黄色或深褐色，质地坚硬持久，结构致密美观，无变形和开裂。它是制作军舰、船只、码头、桥梁、建筑、客车、家具、雕塑和木材的优质材料。柚木在珍贵树种中属速生树种,具有生长快、材质优良、用途广以及投资回报率高等特点,在热带、南亚热带地区广为种植,是世界上人工林种植面积最大的4个树种之一,也是单位面积产值最高的造林树种。柚木引进我国栽培已有180多年历史,现在推广种植范围遍及10个省(自治区)60多个县(市),总面积约1.5万hm2,20世纪70年代初我国开始了柚木遗传育种和栽培技术的系统研究[6,7,8,9,10,11,12,13,14,15]。目前,开展柚木研究的国家主要有印度、泰国和中国等,国外在种源选择、优树选择与测定、无性繁殖技术、无性系变异与育种、材性等方面开展了系统的研究。在常规育种方面[6,7,8,9,10,11,12,13],我国已达到国际先进水平,但在分子育种方面,我国起步较晚,2007年才见有柚木分子生物学研究的报道。自1995年Kertadikara等首次报道柚木分子生物学研究以来,柚木分子育种和常规育种即紧密结合,相辅相成,推动了柚木育种工作的进程。分子生物学理论和技术在柚木遗传育种研究中的应用,一方面使我们更加清晰地认识了柚木种质资源的遗传特性,提高了现有资源的利用效率,为新的柚木资源的收集提供了科学依据,确保了柚木育种工作的可持续性发展;另一方面,为柚木育种提供了新方法,缩短了育种周期,加速了柚木遗传改良的进程,提高了柚木抗逆性。纵观国内外文献,应用于柚木遗传育种研究的分子生物技术包括了同功酶、分子标记、转基因等技术,内容涉及了遗传变异与遗传多样性、种源鉴定、优树和无性系鉴定、分子标记辅助选择育种、抗虫育种和基因克隆等方面。文章对柚木分子生物学方面的研究进行了总结和归纳,并分析讨论目前我国柚木遗传育种研究存在的瓶颈问题,针对性地提出了我国柚木分子生物学研究的迫切性和研究方向,对我国柚木分子生物学的深入研究起到积极地促进作用。1关于杉木分子遗传繁殖的科学研究1.1形态遗传多样性一个树种遗传变异的大小决定了其对生存环境的长期适应能力,而遗传变异研究是对其进行改良利用的重要前提。分子标记是评价树种群体内和群体间遗传变异的有利工具。从现有文献来看,各国柚木研究人员都十分注重种质资源分子遗传变异的基础研究,已报道了柚木同功酶、RAPD、AFLP、SSR和ISSR分子标记技术研究。柚木天然分布范围广,各分布区不连续,或虽连续但分布区内海拔、降雨、地形等生态地理条件差异大,使得柚木具有丰富的遗传变异。Nicodemus等采用RAPD技术分析了印度10个柚木天然种群,得出种的遗传多样性为0.3,种群内基因多样度为0.185~0.261(平均为0.233)。同时发现柚木种群内遗传多样性与纬度呈负相关性,印度南部种群遗传多样性高于中部种群。根据研究结果,印度南部和印度中部地区应看作两个独立的柚木分布地理区域,并加强两地种群的就地保存。众多研究表明,柚木各天然分布区中,印度群体与其它分布国的群体遗传差异明显,且是柚木遗传多样性中心。Fofana等进一步分析显示,各天然分布区的柚木资源分别聚成4个类群,其中2个聚群都为印度群体,是柚木遗传多样性中心;第3个聚群由泰国和老挝的群体组成,它们和印度群体遗传差异明显,但只有一半的等位基因发生变异;第4聚群来自老挝中部,遗传变异最少。柚木地理分布区的不连续和生态差异,也使得柚木种群间遗传差异明显,种群间遗传分化大,因此,失去哪个种群都将丢失柚木的遗传变异。另外,柚木的遗传变异规律存在一定的地理模式,种源间的遗传距离和地理分布距离相关,地理距离近的种源间遗传关系近,不同的种源按地理距离分别聚成一类[20,21,23,25,26,27,30]。Ansari用ISSR标记分析柚木种群显示,群体内遗传多样性占91%,群体间占6.17%,不同生态区域间占2.77%。而Nicodemus等采用RAPD技术分析得出柚木种群内遗传多样性占78%。从多项文献报道来看,研究者采用了不同的分子标记方法,分析的具体柚木材料也有不同,得出的结果会有所差异,不能进行简单的比较。但研究一致显示柚木遗传变异主要存在于群体内,应注重种群内选择以获得更大的遗传基础,可加强柚木优树的选择来开展育种工作。柚木在世界热带、南亚热带地区的引种历史悠久,Kjaer和Fofana等分别发现,有的人工群体可能由于种源间杂交其遗传变异也较高,甚至高于天然群体;有的柚木非天然群体和天然群体遗传多样性相近,可见一些早期人工林或次生林引种后在新环境条件的影响下,产生了新的遗传变异,亦或是所引种的材料来自多个天然群体,使得这些人工林也有较广的遗传基础,这有利于遗传资源的保存,也拓宽了柚木育种材料的选择范围。1.2国外研究现状柚木引种已有300多年的历史,现在遍布世界热带及南亚热带地区,已远远超过其天然分布区,很多国家或地区早期引种的柚木资源来源不清,改良利用具有一定的盲目性,存在一定的风险性。在林木育种过程中,当遇到优良材料或育种材料不清楚的时候,在掌握全分布区或充分资源的情况下,可通过遗传标记分析资源间的亲缘关系或遗传距离来进行来源谱系鉴定,为育种提供明确的亲本或清晰的材料路线,根据育种目标选择出最佳育种亲本或育种材料,在营建高效杂交种子园时更好地选择建园材料和合理地进行配置,充分利用谱系清楚、优势明显和亲缘关系较远的种质资源进行杂交,从而创制出具杂种优势的柚木新种质。柚木种源遗传变异和亲缘关系研究表明,聚类分析能很好的展现地理格局或遗传关系,可以对柚木引种材料追根溯源,这为柚木种源的地理来源鉴定提供了理论和技术基础。Verhaegen等用SSR分析比较了22个印度尼西亚和非洲的柚木种源和17个柚木天然种源,发现贝宁、喀麦隆、科特迪瓦、坦桑尼亚、多哥和塞内加尔的柚木种源有近95%来自印度北部,印度尼西亚和加纳柚木种源有96%来自老挝中部,这和国际柚木种源试验研究所得的结果一致;Fofana等分析了科特迪瓦引种的柚木种源和天然种源的遗传关系,结果显示,柚木种源聚成3类,非洲的柚木种源和印度北部的遗传关系最近,但是有一个种源和泰国种源遗传关系更接近;Shrestha等采用AFLP技术分析了印度、泰国和印度尼西亚的9个柚木天然群体,聚类分析表明,印度尼西亚种群应该来自泰国种群,但印度奥里萨邦(印度东北部海岸附近)的柏培拉种群与泰国种群和印度尼西亚种群聚在一起。1.3研究推广改性措施前人研究结果显示,柚木遗传变异主要存在于群体内,应注重种群内选择以获得更大的遗传基础,柚木优树选择和子代测定可作为开展柚木育种工作的有效途径之一。在进行柚木优树优择时,利用分子标记辅助选择育种,可以大大缩短选育时间,提高资源选育利用效率。目前,已有采用同功酶、RAPD、ISSR和SCAR分子标记技术选择柚木优树和进行柚木无性系鉴定的报道,研究人员通过对不同优树或无性系材料扩增出的特异性标记或部分材料的共有标记,快速准确地选择出了一批优树和无性系,经大田测试后,选择效果较好;最后,利用这些多态性标记,还建立了各无性系的指纹图谱,用于无性系分株的鉴定。在柚木无性系多代繁殖变异方面,Gangopadhyay等用RAPD技术研究了微繁殖不同代数的柚木无性系的遗传一致度,在第5,10,15和20代中依然没有检测到与母株不同的变异,在第25代中检测到1株产生了变异。可见,柚木无性系后代遗传稳定性好,一致度高。1.4用组织化学和基因法进行基因转引病虫害是导致柚木减产的主要原因之一,据马来西亚研究者统计,柚木虫害达22种之多,其中对柚木生长危害最严重的食叶害虫是柚木弄蛾(Hyblaeapuera),使尼伦布尔柚木林的木材量减少44%,引起了各国柚木研究者的高度重视。喷生物杀虫剂控制病虫害覆盖面有限,只能解决小规模病虫害的问题。而通过基因工程,将抗虫基因对柚木材料进行遗传转化,可创造抗病虫害的柚木新品种,是解决该问题的有效途径。国外已经建立了成熟的柚木再生体系和遗传转化体系。Widiyanto等用农杆菌介导法将GUS基因导入柚木嫩芽组织,组织化学检测结果表明,不同的无性系转化率差别较大,无性系P108达到94.6%,而P20只有38.9%;GUS表达最强的组织是叶片和节间组织,其次是顶芽的幼嫩组织。Norwati等以柚木带节茎段(nodalsegment)为外植体,建立了柚木遗传转化体系,采用基因枪法进行了柚木转抗虫cry1A(b)基因、β-glucuronidase(uidA)基因和Bt基因的遗传转化;转化后在MS培养基上培养3个星期,然后转移到含有10μg/mL潮酶素(hygromycin)的培养基上进行筛选,2次筛选后重新接种到MS培养基;通过对转化植株进行GUS检测、PCR分析、Southern杂交和RT-PCR检测,证明外源基因成功转化整合到受体植株中;喂虫试验表明,转基因植株叶片抗虫效果显著。1.5对材料中lhi同簇基因的检测基因克隆和功能鉴定可研究控制树木生长性状的分子机理、进行数量性状基因定位和分子标记辅助选择育种,最终有望实现分子设计遗传改良。Norlia等在2008年克隆了控制柚木开花的LHY同簇基因,命名为(Tg-LHY),该基因cDNA全长为2948bp,编码768种氨基酸,保守区是MYB蛋白,是植物生物钟循环系统中起负反馈响应的DNA绑定蛋白,该基因在天亮开花4h后表达水平高。该研究对柚木开花树龄和花期调控以及种子园丰产技术有重大意义。2中国木条玉的遗传育种问题和建议2.1优良群落的引进和利用100多年来我国已引进、收集和保存了柚木种源102个,包括天然种源30个,国内次生种源72个,这些种质资源是我国柚木育种的基础材料。早期数据显示,我国研究人员、商人和华侨早期(1840—1965年)通过各种途径引进的柚木种源中,有部分种源在适应性、生长和抗性方面表现优良,其种子常被当地人们采收用于人工林建设。为了加速柚木推广利用进程和扩大育种资源储备,对一些稀少的优良资源有必要从其天然群体中增加引种。遗憾的是,国内部分优良次生种源的来源信息没有档案记录,一直以来都给柚木种质资源收集和创新利用造成困扰。因此,根据前人研究结果,可采用分子标记技术,开展国内优良次生种源的地理来源鉴定研究,为柚木种质资源收集和育种亲本的选择提供科学指导,具有极为重要的科学意义和实践意义。2.2dna的检测遗传变异是育种的前提,研究人员需要熟悉掌握柚木种质资源的遗传变异水平、遗传结构和亲缘关系。有关这方面的研究可从表型、细胞、生理和分子4个水平上的遗传标记进行分析,而以分子水平上直接检测遗传物质DNA效率最高,准确可靠。我国主要在生长表型上研究柚木的遗传变异,且测试时间长,受环境因素影响大。因此,迫切需要从DNA分子水平系统研究我国柚木种质资源遗传变异和亲缘关系,挖掘特异性种质资源,评估其遗传改良潜力,以便高效利用所掌握的资源进行种质创新,开展柚木遗传改良工作。2.3选育优良新品系作为一个外来引进树种,柚木在我国热带和南亚热带的发展主要受到酸性土壤和极端低温气候的限制,因此,如何尽快选育出更加高产、优质和多抗的柚木优良新品系,是大力发展柚木种植业面临的一个迫切需要解决的现实问题。通过基因工程创造柚木高抗新材料、新种质和新品种,可大大缩短育种周期,是解决该问题的有效途径。目前,根据我国柚木发展的主要限制因素,宜进行柚木转基因抗寒和耐酸性土壤的新品种选育研究,通过将抗寒和耐酸性土壤基因导入柚木无性系,提高柚木优良无性系的抗逆性,从而扩大栽培区域,适应我国柚木生产发展的需要。当前,国内正在开展这方面的研究。2.4环保节能材料的分子检测根据前人研究结果,今后应更加注重柚木的优树选择,然后进行子代测定,对子代表现优良的无性系进行无性繁殖和推广利用。我国40多年来经过大量的田间测试,已经筛选出了一些速生、抗寒、抗风、抗病和材质优良