健康年龄女性和细菌性阴道病患者阴道菌群的比较

健康年龄女性和细菌性阴道病患者阴道菌群的比较

细菌阴道感染（bv）是女性最常见的阴道感染之一。它可能会导致毛发膜羊膜炎、胎盘早期破裂、早产、子宫内膜炎、盆腔炎、子宫切除术后阴道段感染、妊娠高血压、妊娠高血压、子宫切除后阴道感染和并发症，并增加hiv缺乏的风险。目前治疗BV的主要药物是抗生素,复发率高。尽管经过了50多年的医学研究,其病因及发病机制仍不详,普遍认为是阴道内正常菌群失调所致的一种混合感染。由于阴道菌群多为厌氧菌,营养要求苛刻,使用传统培养方法很难全面地认识正常和病态的阴道菌群分布。随着分子生物技术的发展,尤其是第二代测序技术的出现,使得微生物组学的研究更加全面和准确,但由于成本、测序通量及准确性等原因尚未能够为全世界研究微生物生态(如16Spyrosequencing法)所普遍采用。BarcodedPaired-EndIlluminaSequencing(简称BIPES)操作简便,成本低廉,重现性好,可获得全面、系统、结构化的微生物群落结构信息,为益生菌及益生元在治疗BV的应用奠定基础。本研究利用其对健康育龄期女性和BV患者的阴道菌群进行分析。1材料和方法1材料表面1.1主试剂1.2研究主题1.2.1纳入标准和排除标准均为2012年1月～3月在南方医科大学珠江医院妇产科门诊的患者,共37例,年龄20～45岁。纳入标准:Amsel临床诊断标准的4项内容:①稀薄均质的阴道分泌物粘附于阴道壁,但易于擦下;②阴道pH大于4.5;③在阴道分泌物中见到线索细胞(cluecell);④氨气味试验阳性,其中以发现线索细胞为必备项目+其他3项中的任意2项阳性,同时Nugent评分≥7分诊断为BV。1.2.2阴道混合物质中去血等质性分级为同期本院健康门诊体检育龄期妇女,共37例,年龄在20～45岁之间。通过详细病史询问、阴道清洁度分级、阴道分泌物Nugent评分,纳入标准为同时满足以下3项:①无临床症状;②阴道清洁度分级为Ⅰ～Ⅱ级;③Nugent评分在0～3分。两组均为我国汉族人,同时满足以下条件:患者1月内无全身应用抗生素及阴道局部用药史,3d内无性生活史,非妊娠期、哺乳期或月经期,无糖尿病,没有同时患有滴虫性、霉菌性阴道炎或其它阴道炎。2方法2.1女性阴道混合物16srrna知情同意后,用无菌阴道棉拭子于阴道穹窿取分泌物,避免接触到阴道口和外阴部以防污染。将拭子放入无菌干燥试管中,用于提取16SrRNA基因。健康育龄期女性阴道分泌物样本编号为H1、H2、……H37;细菌性阴道病患者阴道分泌物样本编号为BV1、BV2、……BV37。2.2总dna提取和检测采用试剂盒提取样本总DNA,具体操作步骤参照说明书。提取的总DNA经紫外分光光度计测定纯度,1%琼脂糖凝胶电泳检测后于4℃保存备用。2.31pcr扩增条件以样本总DNA为模版,采用引物967F:CNACGCGAAGAACCTTANC和1046R:CGACAGCCATGCANCACCT扩增其中的16srRNAV6区基因。PCR反应体系(25μl):10×buffer(2.5μl),dNTP(2μl),Mg2+(1.5μl),P1(0.5μl),P2(0.5μl),Ex-taq(0.25μl)模板DNA(1μl),H2O(16.75μl)。PCR扩增条件:94℃预变性2min,然后94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环,72℃最终延伸5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。混合的PCR产物使用QiagenQIAquickGelExtractionKit切胶回收纯化后,通过IlluminaHiSeq2000平台进行双末端100bp测序(华大基因,深圳)。2.4分析测试方法测得序列经过barcodedIlluminapaired-end(PE)sequencing(BIPES)程进行初步处理。去除低质量数据(测序质量较低者);反向互补组装V6序列(比较不同的组装策略);根据barcode将序列分拆到对应样品,去除barcode;切除引物序列,再次去除低质量数据(引物不匹配、含N、过短序列);使用TSC进行聚类,提取出每个操作分类单元(OTU)的代表序列后利用GAST进行物种的分类,其中属于乳酸菌属的OTU利用megablast进一步分到种级别,后续分析包括聚类分析,Alpha多样性和Beta多样性分析。基于Unifrac距离,采用QIIME进行阴道菌群主成分分析。采用lineardiscriminantanalysis(LDA)coupledwitheffectsizemeasurements(LEfSe)在线工具分析BV患者特殊的阴道菌群。3结果3.1之间质控前后样品的拼接质控本实验测序样品数74个,共获得132653条序列,经过BIPES程序拼接质控之后所得序列数为126910条序列,平均每个样品1715条。3.2阴道菌群的形成通过稀释曲线比较两类样品的Alpha多样性,分析显示BV患者的阴道菌群稀释曲线明显比正常组陡峭,提示其菌群多样性较健康育龄期女性明显增加。再进一步使用了两组多样性指数,分别是ObservedOTU和Shannon,来比较H组和BV组的阴道菌群的Alpha多样性。ObservedOTU指数主要受到样品物种丰富度的影响,而Shannon指数同时受到物种丰富度和均度两者的影响。无论是丰富度指数还是Shannon指数,H组和BV组的阴道菌群均出现显著性差异(IndependentSamplesTtest,P<0.001)。3.3阴道菌群聚类分析我们采用QIIME分析流程,采用UniFrac来进行beta多样性分析。该方法展示菌群之间的相似度。每个点表示一个个体的菌群整体,而点与点之间的距离通过两个菌群之间的序列相似度比较获得。PCoA分析显示,无论是基于unweightedUnifrac距离还是weightedUnifrac距离,BV患者的阴道菌群与健康育龄期女性的菌能显著分开,进一步说明二者的菌群结构有明显的区别。为了比较H组与BV组阴道菌群样品的相似性,我们进一步利用primer6.0对H组与BV组阴道菌群样品进行聚类。H组阴道菌群聚在一起,相似度大于90%;BV组阴道菌群聚在一起,相似度约为50%,个体差异较大(图3);两组相似度只有不到10%,表明他们的菌群结构相差甚远。这与图2看到的聚类结果是相一致的。3.4bv患者乳酸杆菌检测在菌属的水平上,H组中相对丰度最高的是乳酸杆菌,约占95%甚至更高,在乳酸杆菌种的水平上,大部分人以L.iners(21例)、L.crispatus(12例)为主,或两者相当(4例),少部分人还存在少量的Ljensenii、L.gasseri,后面两种在所有检测对象中,均未占据主要地位,而是和前两种共存。除了乳酸杆菌,部分正常女性阴道分泌物内可见少量Gardnerella、Granulicatella、Streptococcus、Prevotella、Escherichia和其它菌属。BV患者乳酸杆菌明显减少,其相对比例从45%到1%(24例),以L.iners为主,部分患者(6例)甚至未检出,但有患者(7例)仍是以乳酸杆菌占优势,相对比例从75%～50%,其乳酸杆菌菌种不同于H组,是L.gasseri、L.acidophilus为主,或两者并存,同时存在少量的L.iners和其它菌种。除了乳酸杆菌,Gardnerella、Granulicatella、Prevotella、Parvimonas、Dialister、Escherichia、Peptostreptococcus、Anaerococcus、Streptococcus、Peptoniphilus、Mobiluncus、Klebsiella增多。35例患者检测出Gardenerlla,相对比例1%～95%,Granulicatella(14例),相对比例2%～30%,Prevotella(19例),Sneathia(34例),Dialister(25例),Parvimonas(24例),Peptpstreptococcus(23例),Anaerococcus(33例),Streptococcus(2例),它们与乳酸杆菌一起相对丰度约占98%。3.5lacterity分工LeFSe是新开发的新统计方法,适用于寻找微生物群落标志物。图4中不同的颜色分别表示在两类样品中各自富集的分类单元。分析显示Gardnerella、Coriobacteriaceae、Prevotella、Granulicatella、Lachnospiroceae、Anaerococcus、Parvimonas、Peptoniphilus.harei、Peptostreptococcus、Dialister、Fusobacteriales在BV组显著增加,而L.iners与正常相关性明显。4对bv的和女同性阴道产品中l.crispalus的检测本研究在Solexa测序平台的基础上,采用条码技术,通过配对双末端测序策略(BIPES)测定16SrRNAV6区的方法对正常女性及Amsel标准筛选的BV患者阴道菌群进行检测,借助通用引物深度测序,可以发现低丰度细菌或未知细菌,进而可全面、准确地获得阴道菌群的信息。本研究显示健康育龄期女性乳杆菌是阴道优势菌,约占95%甚至更高,它的分离率高达100%,不同于既往研究,其单独以L.iners或L.crispatus为主,或者两者比例相当,部分病人还存在少量的L.jensenii、L.gasseri。L.iners仅仅存活于血琼脂培养基,而传统培养乳酸杆菌采用Rogosa或MRS等选择培养基,难以对其进行分离和识别。近年来应用分子技术发现L.iners在阴道菌群中具有重要作用。Ling等检测了我国浙江省健康女性阴道分泌物,证实L.crispatus为我国汉族女性最常见的阴道菌群亚型。而Ravel等分析了北美地区白裔、非裔、西班牙裔和亚裔的健康育龄期女性阴道分泌物,发现亚裔的阴道优势菌群为L.iners,而白裔为L.crispatus,提示阴道菌群的构成存在种族差异和地域区别。Antonio等发现即使是同一地区、同一种族女性,作为阴道优势菌群的产H2O2乳杆菌亚群也可以非同一类型,产H2O2能力和pH环境亦有所区别,个体之间存在显著差异性,彭国丽等还发现阴道中的L.crispatus数量在不同季节存在明显差异。本研究发现除了乳酸杆菌,部分正常女性阴道分泌物内可见少量Gardnerella、Granulicatella、Streptococcus、Prevotella、Escherichia和其它菌属。本研究发现按Amsel标准及Nugent评分确诊的37例BV患者中,30例患者乳酸杆菌明显减少,其相对比例从45%到1%(24例),以L.iners为主,部分患者(6例)甚至未检出,与文献报道不同的是有7例患者以L.gasseri、L.acidophilus为优势菌群的,但所占比例较少,部分患者还存在少量的L.jensenii、L.crispatus、L.gasseri、L.acidophilus,在阴道阴道微生态体系所起作用仍未明确,这可能与BV产生耐药,引起复发或者与BV的自身修复作用有关,需要进一步对其进行研究。相关研究发现L.iners是唯一能从BV患者阴道分泌物中检测到的产H2O2乳杆菌亚群,而对于女同性恋人群的BV研究证实了L.gasseri可以促进BV发生。Hernandez-Rodrigue等对墨西哥健康孕妇阴道分泌物检测,发现其阴道菌群中L.acidophius占绝对优势(78%)。本研究发现BV患者阴道菌群中除了乳酸杆菌发生明显变化外,阴道菌群Alpha多样性、beta多样性增加,Gardnerella、Granulicatella、Prevotella、Sneathia、Parvimonas、Dialister、Escherichia、Peptostreptococcus、Anaerococcus、Peptoniphilus、Mobiluncus、Klebsiella等增加。Gardnerella是构成女性正常阴道菌群之一,但在BV时其含量显著增高,其可以利用不替调节分子CD59激活P38-撕裂元-蛋白激酶通路,释放细胞溶解素(Vaginolysin,VLY),致使上皮细胞死亡,VLY是胆固醇依赖溶细胞素(Cholesterol-dependentcytolysin,CDC)家族成员之一,能够识别人类细胞表面补体调节分子CD59,VLY-CD59的交互作用在BV及其并发症的发生具有关键作用。Gardnerella可能通过形成生物膜来耐受抗生素的攻击和抵抗宿主的免疫应答,并且其可产生唾液酸酶和脯氨酸氨肽酶来降解阴道粘膜的保护因子如黏蛋白,使阴道分泌物呈均质样,促进鳞状上皮剥脱和厌氧菌在阴道表面的粘附。Gardnerella等厌氧菌的大量增殖,致使阴道产H2O2乳酸杆菌生长受到抑制,H2O2和乳酸的产生大大减少,同时其可分解氨基酸产生大量的胺,使得阴道pH值升高(pH>4.5)。Marrazzo等发现持续性BV与梭菌门的BVAB1、BVAB2、BVAB3和Peptoniphiluslacri