福建省政和县稻田根结线虫病发生的原因

福建省政和县稻田根结线虫病发生的原因

根结线虫是水稻科的一个重要致病性变量。有10种根结线虫，包括水稻。其中,拟禾本科根结线虫(M.graminicola)在北美洲、南非、亚洲等地区的许多国家均有发生,在旱稻、灌溉地水稻、低洼地水稻、深水稻、苗地上均可侵染为害,造成重大的产量和经济损失。在我国,造成水稻损失的根结线虫有海南根结线虫(M.hainanensis)和林氏根结线虫(M.lini),两者均为我国学者报道的新种,分布于海南和广西水稻产区。拟禾本科根结线虫仅在我国海南三亚的水稻、葱(Alliumtistulosum)上有记录,但未见造成水稻损失的报道。近年来在福建北部山区发生水稻根结线虫病,造成局部严重为害。鉴于其经济重要性及病害的突发性,笔者对病原线虫进行鉴定,对其寄主种类、症状特点和侵染源进行调查,现将研究结果作一报道。1材料和方法1.1病害田间调查水稻根结线虫病发病地点为福建省南平市政和县石屯镇,水稻田为沙滩开发改造地,土质为砂质土。水稻为单季常规稻。观察记述病害症状和田间为害状况,受害田块调查方法采用平行线式,一条线上调查5株,共调查40行、200株,株发病率=调查病株数/调查总株×100%。采集田间及周边的杂草,观察感染根结线虫的情况,进行自然寄主调查和采样。1.2种子采集和苗种繁育选取根系具有典型根结症状的病株及根际土壤装入塑料自封袋中,记录采集时间、地点、寄主名称等。采集线虫样本后,植株分别种植于灭菌的湿润的砂质土中保存种群。单卵囊接种繁育:采集发病水稻根系,于解剖镜下直接剖取单卵囊,接种到预先培植在灭菌砂土上的4～5叶期水稻苗根部进行种群繁育,水稻材料为汕优63。繁育的线虫种群用于形态及分子鉴定。1.3重要形态分类特征的测量雌虫直接从水稻、油芒寄主根部根结剖取,雄虫从根部卵囊处挑离,2龄幼虫由卵囊孵化获得。线虫的杀死、TAF固定、会阴花纹等标本制作均参照文献。根据DeMan公式进行重要形态分类特征的测量和计算。测量的项目包括体长、最大体宽、口针长、背食道腺开口至口针基部球距离、排泄孔至头端距离、尾长、尾后部的透明区长、交合刺长度;计算体长/最大体宽、体长/尾长、泄殖腔至精巢最前端距离/体长×100。每个特征观察20个标本以上。会阴花纹电镜观察采用文献的方法。1.4核电站线虫的分子鉴定1.4.1成虫的解剖及法测定两性根结线虫的单条根结线虫两性刺破根结线虫种群分别为水稻根系采集的FJNPZH1和油芒根系采集的FJNPZH8,在室内水稻上繁育保存。DNA提取参照文献进行。从新鲜的根结中挑取完整的单条根结线虫雌虫,置于灭菌的双蒸水中清洗3次,再放入盛有8μL灭菌的双蒸水的PCR管中,用解剖针将雌虫刺破,加入2μL裂解缓冲液[1×ExTaqPCRBuffer,100μg/mL蛋白酶K(TaKaRa)],迅速放入-20℃冰箱中,至少30min。在PCR扩增前分别在65℃下温育1h,95℃下10min。1.4.2pcr和克隆测序rDNA-ITS区扩增采用的通用引物对为V5367(5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)和26S(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)。28SrDNA-D2/D3区扩增采用的通用引物为D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3′)和D3B(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)。引物由上海Sangon公司设计。PCR体系(50μL)包括模板DNA10μL,10×PCRbuffer(Mg2+)5μL,dNTPs(2.5mmol/L)4μL,上游引物(10μmol/L)3μL、下游引物(10μmol/L)3μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL,加ddH2O至50μL。反应条件如下:94℃下预变性4min,94℃下1min,56℃下1min,72℃下1min,循环35次;最后72℃下延伸10min。4℃下保存备用。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶110V电泳30min进行检测。PCR产物由UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海Sangon公司)回收、纯化、克隆至质粒载体pMD18-T(TaKaRa)上,各种群3个阳性克隆子由上海Sangon公司进行双向测序。利用NCBIBLAST工具、DNAMAN5.2软件,对水稻根结线虫和油芒根结线虫的ITS区(ITS1-5.8S-ITS2)序列、28SrDNA-D2/D3区序列,与GenBank已登录的根结线虫序列进行比对分析。1.5水稻苗根和油胺盐处理采集稻田旁、水渠内的发病油芒根系,于解剖镜下直接剖取单卵囊,同1.2方法接种水稻苗根系。采集无根结的油芒根系,移栽于灭菌砂土中,从水稻根结处剖取单卵囊,接种于油芒细根处。实验在温室内进行,重复5次,定期观察植株根结产生情况。2结果与分析2.1根结及幼虫生长田间调查的植株根部均产生根结,株发病率达100%,病重田块绝产。苗期受害植株,叶黄化、纤弱,发根迟,长势差,死苗多;分蘖期受害植株矮小,叶片黄化,分蘖明显减少(图1-A)。受害植株大多不抽穗,有出穗则表现早熟、穗短,结实少,秕谷多。受害水稻根系发育严重受阻,根尖受害严重,初期稍肿大,根结膨大后可急剧扭曲,大多呈钩状,少数为萝卜状、锤状,老根变褐易腐烂(图1-B、C)。雌虫完全埋生在根组织内,根结大小不等,初期乳白色,后逐渐转为淡黄、棕黄甚至黑褐色。根结上能长出细侧根,侧根受害后产生根结(图1-B、C)。卵囊完全产于根皮层内,不外露,胶质层十分薄,卵粒间易松散,卵可在根内孵化,剖开完整根结,内可见大量孵化的2龄幼虫。后期一部分根结会变褐腐烂,2龄幼虫逸出,或根结表皮裂开,露出白色的卵囊(图1-D)。根结卵囊处基本都可发现雄虫,在大根结内雌虫可多达20条以上。现场采样发现,在稻田水渠旁及水渠上游,均可见大量本地杂草油芒(Eccoilopussp.)(图1-E),其根系长有大量根结,大多形成于根尖,呈锤状,初期乳白色,根结线虫完全埋生于组织中,卵囊也产在组织内,2龄幼虫在根内孵化,部分根结后期变褐腐烂(图1-F),表皮破裂,2龄幼虫逸入沟渠水流,可在沟渠水中分离到2龄幼虫。田间调查发现,光头稗(Echinochloacolonum)、莎草(Cyperusspp.)、早熟禾(Poaannua)等杂草也是水稻根结线虫天然寄主。2.2结果表明，核电站线虫类型评价结果2.2.1背弓、阴门及精巢。根据所有的形貌分为以下3个外接枝点,所有形态转色线,其主要分为5.水稻和油芒根部根结线虫雌虫、雄虫、2龄幼虫的重要分类形态特征如下。雌虫:虫体球形至梨形,有明显的细颈,头架不发达;口针纤细且短,口针基部球发达,横卵圆形,前缘稍向后斜;排泄孔明显,距头端的距离约为口针长的2.4倍,中食道球大,近圆形,瓣门发达,食道腺发达(图2-A)。在光学显微镜下或扫描电镜下可见会阴花纹卵圆形或近圆形,线纹通常平滑细密,侧区不明显;背弓通常高、近方形,有的低、圆,背纹与腹纹通常相连;背弓部、尾端周围及肛门周围常见有短、断裂、不规则的线纹;尾尖明显,阴门区一般无线纹,但在一些样本中可见阴门两侧有细线纹;阴门缝较长,侧尾腺侧口小、明显、紧邻,侧尾腺间距约为阴门裂长度2/3,阴肛距是肛门至侧尾腺距离的2.5倍左右(图2-B～F)。雄虫:虫体蠕虫状,体环明显。头架中等发达,头冠低、光滑、圆,与头区分离;头区与体部连续或缢缩不明显;口针基杆柱状,与口针基部球连接处稍变窄,口针基部球卵圆形,与杆部界线明显,前缘平或略向后斜(图2-G);精巢单条、前伸,少数在前端有反叠,精巢内常见充满精子(图2-H);交合刺发达,引带杆状,尾短,多钝圆,少部尾部为窄圆(图2-I、J)。2龄幼虫:虫体蠕虫状、体环细。头架中等发达,头冠低平或稍微凹陷;唇区与体部连续;口针纤细,基部球小、圆。中食道球椭圆形,瓣门清晰。半月体位于中食道球后,排泄孔紧靠其后(图2-K),食道腺延伸较长,覆盖肠腹面;直肠膨大,尾长、细,尾端透明区长、窄,尾尖,略呈棍棒状(图2-L、M)。根结线虫FJNPZH1种群重要形态分类特征的测量值见表1。2.2.2pcr扩增、克隆测序及测序结果通过通用引物对根结线虫种群FJNPZH1和FJNPZH8进行rDNA-ITS区(ITS1,ITS2,5.8S,部分18S和28S)扩增、克隆、测序,序列长度为789bp,两者序列相似性为100%。GenBank序列登录号分别为HQ420902和HQ420903。将供试两个种群ITS区的序列人工去除18S和28S的序列,将ITS区(ITS1-5.8S-ITS2)序列在GenBank中进行BLAST及DNAMAN5.2比对分析,结果显示与登录的2个拟禾本科根结线虫种群序列相似性高于99%[印度种群Banglore(HM623442)为100%,印度种群Jorhat(HM623443)为99.01%]。供试两个种群的ITS1序列与GenBank中登录的34个拟禾本科根结线虫种群的ITS1序列相似性在96%～100%。根结线虫种群FJNPZH1和FJNPZH8的28SrDNA-D2/D3区经扩增、克隆、测序,序列长度为766bp,两者序列相似性为100%,GenBank序列登录号分别为HQ420904和HQ420905。在GenBank中进行BLAST及DNAMAN5.2比对分析,与拟禾科根结线虫菲律宾种群Mgra(AF435793)只有1个碱基差异,序列相似性为99.87%。2.2.3fjnpzh1种群的生长与dgo通过形态观测,水稻和油芒根部的根结线虫的分类特征与拟禾本科根结线虫原始描述种相符,主要差别在于FJNPZH1种群2龄幼虫口针相对偏长,为13.7(13.0-15.0)μm,原始描述的为11.38(11.2-12.32)μm;FJNPZH1种群雌虫DGO为4.04(2.50-5.00)μm,原始描述的为3.21(2.80-3.92)μm,这些差异应属于种群间正常变异。rDNA-ITS区和28SrDNA-D2/D3序列与GenBank中拟禾本科根结线虫种群的序列相似性均高于99%以上。根据上述观察结果,将水稻和油芒根部的根结线虫鉴定为拟禾本科根结线虫(Meloidogynegraminicola)。2.3稻根结线虫与油管理用油芒根结线虫单卵囊接种水稻苗根部,接种7d后,所有接种的水稻根部均可见到明显根结,后期根结症状与水稻田间根结线虫症状完全一致,呈典型钩状(图3-A),21d后剖取根结,根内可见雌虫已产生卵囊,并孵化出2龄幼虫。用水稻根结线虫单卵囊接种油芒根部,接种7d后,所有油芒根部均可见根结,21d后根结明显,呈锤状(图3-B),剖取根结,可见雌虫已产生卵囊,并孵化出2龄幼虫。交叉接种实验表明,两寄主上根结线虫能相互侵染,并产生典型根结类型。3稻根结线虫及对水稻的影响拟禾本科根结线虫分布于热带与亚热带地区,我国仅在海南三亚的水稻、葱寄主上有记载,但未见其为害的报道。此次在福建省南平市政和县山区水稻田发现的拟禾本科根结线虫,属福建省水稻上新记录线虫种。拟禾本科根结线虫是水稻的最重要病原线虫之一,目前尚无抗病的水稻栽培品种。据国外报道,严重侵染时,旱稻、水稻和直播稻的产量损失可达50%以上。本研究调查的水稻根结线虫病株发病率达100%,为害极其严重,造成水稻绝收。如果不加以控制,可能成为局部地区水稻上新的重要病害。对病害发生条件和侵染特性进行调查,发现水稻根结线虫病的稻田为新垦砂质地,易渗水,通透性好,有利于水稻根结线虫的繁育。拟禾本科根结线虫侵染水稻根系产生根结,卵产于根结组织内的卵囊中,卵囊不外露,2龄幼虫可在根内孵化和直接侵染。这种特殊的生物学特性与水稻根系通气组织有关,有利于在淹水条件下保护根内卵的孵化和2龄幼虫的侵染。拟禾本科根结线虫的模式寄主植物是一些