柿叶多糖对糖尿病小鼠降血糖作用及其机制研究

柿叶多糖对糖尿病小鼠降血糖作用及其机制研究

卡其色最早出现在明代的云南草本植物中，后来在许多草本植物和医书中。我国民间也有用柿叶泡茶饮的习惯。柿叶含有黄酮类、生物碱、挥发油、鞣质、酚类、香素、三萜类、多糖、有机酸、β-胡萝卜素、维生素C、生物态等多种化学成分。急性毒性试验、亚急性毒性试验和长期毒性试验均表明柿叶是一种安全的天然药物。柿叶已被制成中成药用于治疗冠心病、心绞痛、高血压等。目前国内外有关柿叶有效成分应用于糖尿病治疗的药理和临床研究较少,本实验探讨柿叶多糖对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用,并对其作用机制进行初步研究,为柿叶开发利用提供科学依据。1材料表面1.1柿叶粗多糖的制备柿叶粉碎,粗粉用70%乙醇冷浸30min后,回流提取2h,过滤,药渣自然挥干乙醇,加水煮沸,微沸1.5h,过滤,滤渣再次加水煮沸,微沸1.5h,合并滤液,滤液于3000r·min-1离心20min,取上清液于微波干燥器浓缩浓缩液加95%乙醇,混匀、静置24h,抽滤,滤渣依次用无水乙醇、丙酮洗涤5次,挥干溶剂后,经Sevag法去蛋白处理,得柿叶粗多糖,经化学定性鉴别,为多糖类化合物。1.2实验动物及动物清洁级昆明种小鼠,雌雄兼有,体重(25±3)g,购自广西医科大学实验动物中心,合格证号SCXK(桂)2003-0003;动物饲料是由广西医科大学实验动物中心生产(标准饲料)。1.3试验药物链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ):深圳晶美公司进口分装,ProductID:380-010-G001。优降糖(格列本脲Glibenclamide):浙江南洋药业有限公司,规格2.5mg/片,批号20051101。血糖试剂盒:四川迈克科技股份有限责任公司生产,批号1106121。胰岛素放射免疫分析试剂盒:北京北方生物技术研究所产品,批号20070120。丙二醛(MDA)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所第一分所,批号20061206。超氧化物歧化酶(SOD)测试盒:南京建成生物工程研究所第一分所,批号20070131。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒:南京建成生物工程研究所第一分所,批号20070103。1.4实验仪器与设备722S紫外分光光度计:上海精密科学仪器有限责任公司。RE-52旋转式蒸发器:上海安亭实验仪器有限公司。GC-1200γ放免计数盒:中国科技大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司。微波真空干燥机:WBZ-2,贵阳新奇微波工业有限责任公司。高速冷冻离心机:TGL-16G-A,上海市金鹏分析仪器有限公司。2方法2.1柠檬酸/柠柠檬酸钠缓冲液配制小鼠禁食12h,按文献并做预试后,以150mg·kg-1链脲佐菌素(STZ)ip(STZ溶于0.1mol·L-1,pH4.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中,现配现用,冰浴保存)。正常对照组小鼠ip等量上述缓冲液。72h后(小鼠采血前禁食12h)眼内眦采血,50μL,用生理盐水稀释5倍,于离心机3500r·min-1离心15min,分离血清,用葡萄糖试剂盒测定小鼠空腹血糖(FBG),凡FBG≥11.1mmol·L-1视为糖尿病动物模型。2.2格列本推行推行柿叶多糖将成模小鼠随机分为正常对照组、模型组、格列本脲组、柿叶多糖低、高剂量组,各组小鼠自由饮水、每组小鼠每日上午和下午2次给予同样量饲料,以适当控制摄食。ig给药,格列本脲组(25mg·kg-1·d-1),柿叶多糖高低、高剂量组(150,600mg·kg-1·d-1),用时配成等体积不同浓度溶液(小鼠ig10mL·kg-1)。柿叶多糖用无水乙醇、吐温、蒸馏水按1∶1∶10的比例配成溶液。成模后第2d开始给药,每天上午空腹给药1次,连续ig15d。模型对照组小鼠ig10mL·kg-1上述空白溶剂。2.3一般指标观察小鼠的精神活动、毛发改变、饮水量、进食量、大小便等一般状态,并记录体重变化情况、死亡情况等。2.4空腹血糖检测造模第3d用采血针刺破眼内眦,取血50μL,用生理盐水稀释5倍,于离心机3500r·min-1离心15min,分离血清,用葡萄糖试剂盒测定小鼠空腹血糖(FBG)。成模小鼠进行随机分组,第2d开始给药。以后分别在用药第7,15d用葡萄糖氧化酶法测定各组FBG。2.5空腹胰岛素水平给药第15d,各组小鼠拔眼球采血,分离血清,用放射免疫法测定空腹胰岛素(FINS)水平。计算胰岛素敏感指数(ISI),计算公式:2.6小鼠血糖检测测定重复2.1,2.2操作。用药第3周时,各组口服葡萄糖2.5g·kg-1,分别测定0,0.5,1,2h各组小鼠血糖值,比较口服葡萄糖耐量(OGTT)变化情况,并计算糖耐量血糖曲线下面积(AUC)。2.7测定项目及方法各组小鼠给药第15d拔眼球采血后,处死,取肝组织,用冰生理盐水清洗,滤纸吸干,称重后低温冰箱冷冻保存,测定前取出用生理盐水配成10%肝组织液,用高速匀质机制成10%肝组织匀浆,于冷冻离心机3000r·min-1离心15min,取上清液按要求用生理盐水稀释一定倍数后用于肝组织蛋白含量、肝组织MDA、肝组织SOD测定。组织蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝蛋白测定法;MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法;SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法。2.8统计方法数据采用x±s表示。采用SPSS11.5.统计软件进行统计分析。P<0.05有统计学意义。3结果3.1各组小鼠一般情况正常小鼠造模成功后出现精神萎靡,形体消瘦、多食、多饮和多尿等症状。ig给药后,格列本脲组、柿叶多糖低、高剂量组较模型组小鼠状态有较明显改善,精神状态良好。体重较模型组有所增加。3.2格列本对柿叶多糖低、高剂量对大鼠血糖的影响给药期间,与同期糖尿病模型组比较,格列本脲组,柿叶多糖低、高剂量组,有显著降低血糖的作用(P<0.01或0.05)。结果见表1。3.3两组患者胰岛素敏感指数比较STZ所致糖尿病小鼠与正常小鼠相比胰岛素水平异常升高,出现胰岛素抵抗,用药后柿叶多糖低、高剂量组,胰岛素敏感指数均提高。结果见表2。3.4糖耐量血糖曲线下面积与糖尿病模型组比较,柿叶多糖高剂量组口服葡萄糖后血糖水平下降较快,糖耐量血糖曲线下面积(AUC)与模型组比较有显著性差异(P<0.01),且作用优于格列本脲组(P<0.01或0.05)结果见表3。3.5小鼠肝组织抗氧化能力STZ所致糖尿病各组小鼠肝组织中MDA较正常组有显著增高,SOD显著降低,显示糖尿病小鼠肝组织抗氧化能力下降。用药15d后,与模型组比较柿叶多糖有效降低肝组织MDA,相应增高SOD活力(P<0.01),结果见表4。3.6小鼠胰岛细胞损伤显微镜下观察:正常组织胰腺由浆液性腺细胞和导管组成,胰岛由大小不等的细胞团构成,分布在腺泡之间,胰岛数量最多,体积较大;模型组胰腺由浆液性腺细胞和导管组成,胰岛由大小不等的细胞团构成,分布在腺泡之间,胰岛细胞数量明显减少,分布稀疏;表明STZ所致糖尿病小鼠胰岛细胞有一定损伤。显微镜下胰岛细胞计数:各组胰腺内胰岛的分布总数平均为(n=3)∶正常组24(个/切片),模型组5(个/切片),格列本脲16(个/切片),柿叶多糖低剂量6(个/切片)、柿叶多糖高剂量17(个/切片)。结果提示:柿叶多糖对胰岛细胞有一定的保护和修复作用。4提高抗氧化酶系统的检测结果糖尿病患者最典型的临床特征为高血糖,持续的高血糖不仅引起广泛的周围组织和器官的损害,而且高血糖对胰岛β细胞亦有“细胞毒性作用”,因此在糖尿病的治疗中如何有效持久地控制血糖成为关键。本实验结果显示,柿叶多糖对糖尿病小鼠的血糖具有显著降低作用,同时其也能显著改善糖尿病小鼠的糖耐量,而且其作用优于格列本脲组;应用柿叶多糖后,糖尿病小鼠状态有较明显的改善,精神状态良好,死亡率低,并能减缓实验性糖尿病小鼠体重的下降。文献报道糖尿病患者和糖尿病动物模型的抗氧化能力均有下降,在糖尿病的发展过程中伴随自由基对肝组织的氧化损伤,同时,链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的肝细胞肿大、轻度变形,肝窦变窄甚至消失,肝脏抗氧化能力显著下降。本实验结果表明,柿叶多糖能显著提高肝脏SOD活性、降低MDA含量。显微镜下胰岛细胞计数:柿叶多糖高剂量组胰岛细胞计数明显增加,提示柿叶多糖对胰岛细胞有较好的保护和修复作用。因此,提高抗氧化酶活性,增强机体的抗氧化能力,清除活性氧自由基以解除自由基对肝脏和胰岛β-细胞的损伤,促进肝脏功能的恢复和胰岛β-细胞的修复和再生,可能是柿叶多糖降血糖作用的机制之一。胰岛素抵抗贯穿