rh缺失型d-个体及其家系成员rh和rhce基因序列变异分析

rh缺失型d--个体及其家系成员rh和rhce基因序列变异分析

rh血型是最复杂的红细胞血型系统，具有高度多态性。它的临床意义仅次于abo血型。Rh缺失型D--是Rh血型系统中极为罕见的变异体,血清学表现为D抗原增强及C、c、E、e抗原的缺失。Rh缺失型D--个体,通过输血或妊娠,通常会产生针对Rh高频率抗原的抗体,造成输血前配血极为困难,且再次妊娠时极易引起严重的新生儿溶血病(Hemolyticdiseaseofnewborn,HDN)。我们在为1名产妇进行交叉配血时发现,其血清学表现为C、c、E、e抗原皆缺失,表现为Rh缺失型D--。为了解该个体出现Rh缺失型D--的原因,本文对其及其家系成员进行了RHD及RHCE基因分型及遗传背景分析,现将结果报道如下。1.数据和方法1.1新生儿溶血病产妇,女,33岁,有输血史及妊娠史(孕3胎产3胎,1999年产第1胎,健康成活;2000年产第2胎,未能成活),已产男婴1名(系第3胎)。产后发现小儿全身皮肤黄疸,呈进行性加重,经实验室检查,红细胞计数:1.13×1012个/L;Hb:54g/L;网织红细胞比值:0.33;有核红细胞:140个/100个白细胞;血清总胆红素:266.25μmol/L。临床初步诊断为新生儿溶血病。产妇因产后大出血,需输血。为查明新生儿溶血病产生的原因及为产妇提供相配的血液输注,医院将产妇及其患儿标本送本单位作进一步检查及交叉配血。标本送达本单位时,患儿已因病情过重而死亡。前期已完成对其家系Rh血型血清学的调查,见图1。1.2主试剂基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)和PCR-SSPCDE检测试剂盒均由德国Inno-train公司提供。1.3缺失型d--个体/家系成员edta出现型的检测使用基因组DNA提取试剂盒,从Rh缺失型D--个体及其家系成员EDTA抗凝全血中提取基因组DNA,用蒸馏水将浓度调节至约50ng/μl。1.4pcr反应体系及条件采用PCR-SSPCDE检测试剂盒分别对Rh缺失型D--个体及其家系成员RHD基因第1、2、3、4、5、6、7、9、10外显子及RHCE基因特征性片段进行PCR扩增,PCR产物及检测基因见表1。反应体系为:双蒸水6μl,引物混合物3μl,Taq酶0.08μl(0.4U),DNA1μl。反应条件为:94℃2min,1个循环;94℃20s,70℃60s,5个循环;94℃20s,65℃60s,72℃45s,10个循环;94℃20s,61℃50s,72℃45s,20个循环;72℃5min,1个循环;10℃保存产物。取10μlPCR产物,直接点样于含0.7μg/mlEtBr的2%琼脂糖凝胶中,电泳(8~10V/cm)20min,在凝胶成像系统中的紫外光下拍照记录。每个反应管内均含434bp的内对照物,电泳后所有阴性反应管应出现该对照带。2.rhce基因检测先证者及其家系成员PCR结果与血清学表型基本相符。先证者RHD基因未见异常,未检出RHCE基因的特异性序列,其他家系成员均有正常表型及RHCE基因PCR产物,见图2、图3及表2。3.rh缺失型Rh血型基因位于人类1号染色体短臂上,由紧密连锁的RHD基因与RHCE基因串联排列组成。RHD基因编码RHD抗原,RHCE基因编码C,c,E,e抗原。两基因具有高度同源性,二者的外显子与内含子有93.8%的同源性。RHD基因和RHCE基因尾对尾排列(5′RHD3′-3′RHCE5′),二者之间会出现基因片段的置换重排,形成极为复杂的Rh血型多态性。首例D--表型是由Race等发现的,其个体红细胞上有D表达,但无C、c、E、e,猜测是D--纯合子。Rh缺失型D--的RHCE基因结构非常复杂,包括RHD与RHCE基因之间的互换和重组、外显子重排、缺失、交换、插入和基因的位点突变等;Rh抗原的表达还与Rh相关糖蛋白(RHAG)密切相关,这些糖蛋白出现异常,对Rh抗原均有影响,甚至导致Rh抗原的缺失或不表达。国外对Rh缺失型D--产生的机制报道较多。在1个法国Rh缺失型D--献血者和2个美国印第安家系中的Rh缺失型D--个体中,具有完整的RHD基因和RHCE基因,其RHCE基因可能发生了剪并。在冰岛、英国和意大利发现的Rh缺失型D--个体中,只有外显子1和10是RHCE的,其余皆被RHD取代。对另外2例意大利Rh缺失型D--个体的研究发现,有两种杂交基因,一种是RHCE-D-CE-D,其中只有外显子1和9是RHCE提供的;另一种是RHD-CE,其中只有外显子10是RHCE提供的。对一个同一家系中2名有Dc-表型的中国家庭6名成员进行研究发现,该2名Dc-个体均具有Dc-和D-基因,其中发生RHD与RHCE基因之间的互换和重组,形成RHD(1-9)/RHCE(10)和RHCE(1-3)、RHD(4-10)。国内对D--产生机制的研究报道较少。杨丽艳等报道的1例D--,先证者的Rh基因分型结果为CCDee,表明其RHCE并非完全缺失。李碧娟等报道的2例D--,1例为第5外显子第22位核苷酸缺失,48与90位发生突变,另1例为第5外显子第89位发生突变。张静蕊等报道的两例D--,1例检出e基因,另1例检出C、c、e基因,认为是RHD与RHCE基因发生重排造成的。郑月明等报道的1例D--,认为是先证者父母均有CE基因的部分缺失,遗传所致。PCR-SSP作为一种特异性的DNA序列多态性分析技术,具有费用较低、操作简便和特异性强等优点,是目前国外最常用的RHCE基因分型方法。孙志刚等用PCR-SSP对400例个体进行RHCE基因型的检测,得到了与血清学分型完全一致的结果,认为亚洲黄种人RHCE基因的遗传背景比较单纯,杂合基因产生的概率较小,RHCE基因的突变相对较少,因此使用PCR-SSP对亚洲人进行RHCE基因分型,结果可靠,重复性好。本例应用PCR-SSP对先证者及其家系成员RHD、RHCE基因进行分型,结果显示先证者家系成员PCR结果与血清学表型基本相符,对其RHD基因9个外显子PCR扩增产物进行分析,显示为正常的RHD基因,未见RHCE基因片段的插入和互换。而RHCE基因特异性序列PCR扩增产物分析显示,无RHCE基因特异性序列,因此该先证者的RHCE基因极有可能大部分或全部缺失。其他家系成员均有正常表型及RHCE基因PCR产物。在PCR产物分析时,先证者母亲出现Dpsi、cw条带、其兄出现Dpsi条带,结合其家系进行分析发现,与先证者及其姐妹的PCR产物结果有矛盾,无法从遗传学角度去解释,因此考虑为PCR假阳性结果,分析时不予考虑。Rh缺失型D--往往是由近亲婚配引起的。但也有文献报道,亲代杂合状态的正常表型也可引起子代的完全缺失。对于本例,根据先证者家系血清学与PCR结果,其母、兄、姐、妹、女、子均有正常表型,而其本人RHCE基因缺失,很可能其父母双方分别携带一条D--单倍型,为RHCE基因缺失型杂合状态,在遗传时将D--单倍型均遗传给先证者,从而造成先证者为Rh缺失型D--,其姐、妹、女、子均为RHCE基因缺失型杂合状态。推断先证者家系基因型很可能为:父亲:DCe/D--,母亲:DcE/D--,其兄:DCe/DcE,其姐:DcE/D--,其妹:DcE/D--,先证者D--/D--,其夫:DCe/DCe,其女:DCe/D--,其子:DCe/D--。上述结果是根据目前实验结果得到的最有可能的推断。若要得到确切的结论,必须对该家系进行更深入的分析,如对该家系成