宫颈癌组织中hpv16e6mrna表达与survilin蛋白表达的相关性研究

宫颈癌组织中hpv16e6mrna表达与survilin蛋白表达的相关性研究

细胞死亡与肿瘤形成之间的关系是研究肿瘤的热点。人头瘤病毒（pv）16的dna水平与宫颈表皮内肿瘤（cin）的进展密切相关。本研究通过采用半定量PCR法和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法,检测宫颈癌及癌前病变组织中HPV16E6mRNA的表达水平及survivin蛋白阳性表达率,并探讨两者的相关性。材料和方法一、患者性别、年龄及病理检查选取2003年3月—2004年2月在中南大学湘雅二医院及湖南省妇幼保健院行阴道镜下宫颈活检、宫颈电圈切除术(LEEP)或子宫切除术共148例患者作为本研究对象。患者年龄为20～67岁,平均(41.0±0.9)岁。切除的宫颈标本均经病理检查确诊,包括慢性宫颈炎57例、CINⅠ30例、CINⅡ～Ⅲ30例及宫颈癌31例。宫颈癌患者术前均未进行过放疗、化疗。宫颈癌患者中,病理类型:鳞癌25例,腺癌6例;病理分级:高分化12例,中分化11例,低分化8例;临床分期[按国际妇产科联盟(FIGO)1995年标准]:Ⅰ期16例,Ⅱ期10例,Ⅲ～Ⅳ期5例。二、方法1.dna的抽提每例患者手术或活检时留取小部分宫颈组织,立即放入-70℃液氮罐中保存待测。检测时取出液氮罐中的宫颈组织碾碎,加入裂解液2.0ml、2%十二烷基硫酸钠(SDS)0.5ml、20mg/ml蛋白酶K25μl混匀,37℃水浴消化过夜后,酚-氯仿法常规抽提DNA,-20℃保存备用;其余组织全部送病理检查,以明确诊断,每份标本的石蜡块均连续切片2张(1张行HE染色),厚4～5μm。2.pcr扩增E6mRNA的表达:(1)宫颈组织标本定性检测:先对148份宫颈组织标本进行定性检测,自行设计的HPV16上下游引物对应于HPV16基因序列165～368bp的编码区,上游引物序列为:5′-TTGCTTTTCGGGATTTATGC-3′,下游引物序列为:5′-CAGGACACAGCTTTTGA-3′,扩增片段长度为204bp。反应体系内含10×Buffer、1.5mmol/LMgCl2、0.2mmol/LDNA聚合酶1U。上下游引物各100pmol/L、模板DNA100ng。反应条件为95℃预变性5min;95℃40s,56℃35s,72℃50s,循环26次;最后72℃延伸10min。(2)HPV16E6同管扩增:选取HPV16阳性的标本,再用HPV16E6上下游引物和β肌动蛋白(β-actin)上下游引物同管行PCR扩增,β-actin上下游引物对应于β-actin基因序列136～484bp编码区,上游引物序列为:5′-CAGCAAGCAGGAGTATGACG-3′,下游引物序列为:5′-ATGGCAAGGGACTTCCTGTA-3′,扩增片段长度为349bp。反应体系及反应条件中,除将HPV16上下游引物各100pmol/L换为β-actin上下游引物各33μmol/L外,其他同上。每次PCR反应均以正常胎盘组织DNA代替模板DNA为阴性对照,以生理盐水代替模板DNA为空白对照,同时行PCR扩增。(3)结果判断:取2.5μlPCR扩增产物,于6%PAGE胶中电泳,与DNA标准相对分子质量(100bpLadder)进行对照,出现204bp条带者为HPV16阳性;出现349bp条带者为β-actin阳性。于紫外光下观察电泳条带、摄像,用gengenius软件分析结果,见图1。3.乳腺癌蛋白检测(1)采用微波抗原修复,SP法具体操作按试剂盒(购自福州迈新公司)说明书进行(浓缩型兔抗人survivin多克隆抗体购自美国Neomarker公司)。以磷酸盐缓液(PBS)代替一抗作为阴性对照,用survivin乳腺癌阳性片作为阳性对照。(2)结果判断:光镜下观察,survivin蛋白染色阳性信号为黄色或棕褐色颗粒,主要位于细胞质。100倍视野下观察,每张切片随机选取5个区域,根据细胞染色程度和染色细胞的百分率进行综合评分。染色程度:基本不着色为0分,着色淡为1分,着色中等为2分,着色深为3分;着色细胞占计数细胞的百分率:≤5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,>50%为3分。将每张切片上述两项评分之积为其综合评分,综合评分≤1分为阴性,2～3分为弱阳性,4～6分为阳性,>6分为强阳性。4.mrna的表达水平应用SPSS11.0统计软件进行统计学分析。不同病变程度的宫颈组织中HPV16E6mRNA的表达水平,采用方差分析;survivin蛋白阳性表达率,采用秩和检验;survivin表达率与宫颈癌临床病理特征的关系,采用χ2检验;HPV16E6mRNA的表达水平与survin蛋白阳性表达率的相关性,采用Spearman等级相关分析。结果一、不同病变程度高校pv136mrna表达水平148份宫颈组织标本中,筛选出HPV16阳性标本37份,37份HPV16阳性标本目的基因与内参照基因扩增产物的比值在0.046～3.319之间。37份HPV16阳性标本中,不同病变程度宫颈组织中HPV16E6mRNA的表达水平见表1,HPV16E6mRNA的表达水平随宫颈病变程度的加重而升高。CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组织中HPV16E6mRNA的表达水平与慢性宫颈炎及CINⅠ组织比较,差异均有统计学意义(P<0.01);宫颈癌与CINⅡ～Ⅲ组织,及CINⅠ与慢性宫颈炎组织比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。二、慢性宫颈炎及cin组织CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组织中,survivin蛋白的阳性表达率均高于慢性宫颈炎及CINⅠ组织,两者比较,差异均有统计学意义(P<0.01);而宫颈癌与CINⅡ～Ⅲ,及CINⅠ与慢性宫颈炎组织比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。三、强调高中分化的妊娠组织低分化的宫颈癌组织中,survivin蛋白阳性表达率显著高于高、中分化的宫颈癌组织,两者比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而与年龄、临床分期及病理类型无关,两者比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。四、微管相关因素与实际小鼠抗氧化性表达的关系对宫颈癌组织中15份HPV16阳性标本的HPV16E6mRNA的表达水平与survivin蛋白阳性表达率进行Spearman等级相关分析,结果显示,两者呈显著正相关关系(γs=0.62,P<0.05)。讨论一、同管扩增半定量pcr检测因子分析HPV感染与CIN均具有暂时性、一过性的特点。Chan等在研究93例CINⅡ～Ⅲ的自然转归时发现,无HPV感染患者,CIN逆转的发生是HPV持续感染患者的4倍。因此,及时预测CIN的转归,对于临床正确处理CIN,无疑是至关重要的。通过检测HPV16E6mRNA的表达水平,可有助于HPV16致癌基因E6致癌机理的研究。目前,采用定量PCR技术检测HPV的研究,尚仅有少数报道,且因其所用检测仪器昂贵而使其应用受到限制。本研究采用的相对简单而经济的同管扩增半定量PCR技术,分析了不同病变程度宫颈CIN及宫颈癌组织中HPV16E6mRNA的表达水平发现,HPV16E6mRNA的表达水平随CIN程度的加重而呈上升趋势,与马彩玲等应用定量PCR技术检测的结果相似。本研究以HPV16E6mRNA与β-actin扩增产物的比值作为HPV16E6mRNA的表达水平,较其他半定量PCR技术检测,同管扩增半定量PCR技术检测,具有一定的灵敏性及准确性,不需要特定的仪器,简便易行,适于临床采用。本研究结果提示,应用同管扩增半定量PCR技术,检测宫颈组织中HPV16E6mRNA的表达水平是可行的,半定量检测HPV16E6mRNA的表达水平,可能作为判断CIN的病变程度及转归的参考指标。本研究比较了慢性宫颈炎、CIN及宫颈癌不同组织中HPV16E6mRNA表达的水平发现,宫颈癌及CINⅡ～Ⅲ组织中HPV16E6mRNA的表达水平显著高于慢性宫颈炎及CINⅠ组织。由此可见,伴有HPV16感染的慢性宫颈炎及CINⅠ在可能转变为癌的过程中,伴随HPV16E6mRNA表达水平的增高,从分子水平上进一步证实了HPV16E6与宫颈癌的发生密切相关。二、低分化妊娠中创新蛋白表达survivin蛋白属于凋亡抑制蛋白的新成员,是迄今发现的作用最强的凋亡抑制因子。本研究显示,宫颈癌与CINⅡ～Ⅲ组织中,survivin蛋白的阳性率显著高于慢性宫颈炎及CINⅠ组织,与Kim等报道的一致;并且从慢性宫颈炎→CIN→宫颈癌的演变过程中,survivin蛋白的阳性表达率逐渐升高,表明survivin蛋白的再激活可能与宫颈癌的发生、发展密切相关。有文献报道,survivin蛋白表达上调,提示宫颈癌的高侵袭性、患者生存期短和预后不良。本研究结果发现,低分化宫颈癌组织中,survivin蛋白的阳性表达率明显高于高、中分化癌组织;但在不同年龄、临床分期及病理类型的宫颈癌组织中,survivin蛋白的阳性表达率比较,差异均无统计学意义,这可能与本研究宫颈癌组织标本,尤其是腺癌组织标本相对较少有关。三、pv16emrna的表达水平与保护方式Frost等研究发现,在survivin蛋白阳性表达的CINⅠ组织中,同时检测有HPV感染的标本中,survivin蛋白表达为强阳性;而无HPV感染的标本中,survivin蛋白表达仅为轻、中度阳性;有HPV感染的标本中,su