现代分子标记技术在番茄抗病性状和数量抗病性状基因定位中的研究进展

现代分子标记技术在番茄抗病性状和数量抗病性状基因定位中的研究进展

作为一种重要的蔬菜品种，番茄在种植面积上是广泛的。然而，一些疾病的发生严重影响了番茄的产量和质量。培育优良的抗病品种一直是番茄育种工作者的重要目标。现代分子标记技术的迅速发展为番茄抗病育种工作者提供了有利的辅助工具。以下为介绍分子标记技术在番茄抗病基因定位研究中的进展。1enicwell多维分析,nils方法,nirs质量性状通常由一个或少数几个主基因控制,遗传相对简单。质量抗病基因定位既可利用已有的连锁图谱,也可利用近等基因系(nearisogeniclines,NILs)(Muehlbaueretal.,1989)和分离群体分组分析法(bulkedsegregantsanalysis,BSA)(Michelmoreetal.,1991)。而实际工作中往往是几种方法的同时运用,番茄质量抗病性状的基因定位主要集中在番茄烟草花叶病毒病、番茄根结线虫、番茄细菌性斑疹病、番茄白粉病、番茄叶霉病、番茄斑枯病、番茄斑萎病等。1.1与tm2-rapd标记的比较番茄烟草花叶病毒病(tobaccomosaicvirus,TMV)是番茄发生普遍,危害最重的病害之一,往往可以造成番茄的绝产。在番茄中目前已鉴定出了3个显性抗病基因Tm-1、Tm-2和Tm-22(或Tm-2a)。找到与这些基因紧密连锁的标记,对于抗病植株筛选和基因克隆都是必要和有益的。早在1989年,Young和Tanksley就用RFLP技术来分析随Tm2或Tm2a进入L.esculentum的染色体片段。他们选择Tm2座位两侧的RFLP标记,分别检测了12个不同育种来源的Tm2和Tm2a品系,发现渗入片段,图距可达51cM,最短的只有4cM左右。(Motoyoshietal.,1996)利用近等基因系,以RAPD标记分析Tm2座位,经鉴别在220个随机引物中得到13个标记,位于Tm-2及其紧密连锁的nv座位两侧的2.7cM左右的范围内。Ohmori等(1995)找到了与Tm-2基因紧密连锁的RAPD标记。并把其中的OPI18900,OPE16900和OPG09700等四个PAPD标记成功的转化为SCB121200,SCI18900,SCE16900andSCG09700等四个SCAR标记。同时Motoyoshi等(1996)找到了与Tm-2紧密连锁的两个标记OPE16900和OPN311000,并把13个标记中的6个克隆测序,Southern杂交分析表明:其中一个为单拷贝序列,其余为中度或高拷贝序列。Sobir等(2000)分析了与Tm-2紧密连锁的SCAR标记的特点。Ohmori等(1996)找到了与Tm-1基因紧密连锁的6个RAPD标记,而且将其转为与Tm-1基因共分离的SCAR标记。Pillen等(1996)利用2112个回交群体,对Tm2a区域高分辨率遗传图谱进行了构建,在周围约4.3cM的范围内定位了13个RFLP标记和RAPD标记,其中10个标记集中在0.2cM的窄小范围内,而离Tm2a最近的两侧标记仅相距0.05cM。有一个RFLP标记(R12)与Tm2a呈共分离现象。利用Tm-2两侧遗传距离为1cM的RFLP标记,只用两代就可以获得导入片段仅为2cM的含Tm-2基因的植株,而用常规方法至少需要100代才能得到同样的结果。Young等(1988)将与Tm2a紧密连锁的两个标记制成了探针,这有利于植株后代的选择。并在与Tm2a距离0.4cM的范围进行了作图,成为该基因的克隆起点。Dax等(1998)利用两个近等基因系Tom-1S和Tom-1R,找到了两个共显性的RAPD标记,长度分别为450bp和500bp,并将其转化为稳定的SCAR标记,来鉴定分离群体的杂和性和纯和性,这为育种工作提供了一种方便、快速的方法。田苗英等(2000)运用RAPD技术和BSA法,找到了一个与Tm2-nv基因连锁的分子标记OPD201700(7.067cM)。Dax等(1994)利用近等基因系和RAPD技术找到了与Tm-2a紧密连锁的标记LA1791,经验证F2代符和1∶3的分离比例。1.2mi-1与其它植物抗感基因的共聚性分析感染了根结线虫(Meloidogyneincognita)是番茄生产损失的一个重要原因之一。(彭德良和唐文华,2001)目前在番茄中新发现的抗根结线虫基因有8个,原来的Mi抗性位点表示为Mi-1,新发现的抗性基因分别称作Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-7、Mi-8、Mi-9,为番茄抗根结线虫育种提供了丰富的遗传资源。其中4个抗性基因Mi-1、Mi-3、Mi-9、Mi-5被分别定位在番茄第6染色体和第12染色体上,并且利用高密度图谱已经克隆出的Mi-1基因与其它植物抗病基因具有相似性。Xu等(2001)找到了与Mi连锁的1个RAPD标记,并把它转化为SCAR标记。Klein-Lankhorst等(1991a)利用83M7133和83M7138两个近等基因系(只在Mi和Asp-1位点有差异的群体),找到了两个RFLP标记(GP79和H6A202)和3个RAPD标记。均与番茄根结线虫基因紧密连锁,并且利用GP79标记能鉴定具有抗根结线虫性状的番茄植株的杂合性和纯合性,从而为育种工作提供了方便。vanDaelen等(1993)利用这两个标记和已有的对Aps-1和GP79之间的范围进行了图谱分析。为基因的最后克隆奠定了基础。Ho等(1992)找到了与Mi基因连锁的一RFLP标记、一个PCR标记PEX-1,其中PEX-1,由于与Mi基因的紧密连锁,PEX-1已成为育种过程中鉴定Mi基因的重要标记之一。Mi-3是Yaghoobi等(1995)在秘鲁番茄的一份材料中发现的抗线虫基因,呈显性单基因遗传,可在32℃的温度下保持抗线虫能力。利用BSA群体,建立抗感基因池,用520种寡聚核苷酸引物进行筛选,得到2个标记与Mi-3紧密连锁,并利用标记NR-14和RFLP标记TG180,将Mi-3定位于番茄第12条染色体短臂的近端区域。Klein-Lankhorst等(1991b)找到了多个与Mi连锁的RFLP标记。Messeguer等(1991)建立了Mi基因的高饱和RFLP图谱。1.3抗白酒分子标记的建立番茄白粉病是保护地内日趋严重的一种病害。根据病原物的不同,目前标记的抗番茄白粉病的基因主要有两个:LV和Ol-1。Chunwongse等(1994)利用BSA法和RAPD技术得到了与番茄白粉病抗性基因(LV)连锁的RAPD标记OP248(700bp片段、第12条染色体),与RFLP标记CT134距离仅为1cM。并且把它定位在RFLP两个标记CT121andCT129的0.84cM的范围内。其中CT121标记与LV只相距0.16cM,(Chunwongseetal.,1997)并利用这些标记基因建立了该基因的高密度图谱,为该基因的最后克隆奠定了基础。vanderBeek等(1994)报道了来自多毛番茄的抗白粉病不完全显性基因Ol-1,筛选出一个RAPD引物,其产物与之共分离,并定位于第6染色体上的接近同工酶标记Asp-1附近的区域内,与Mi和Cf-2/Cf-5相邻。Huang等(2000)利用易感品种Mongker和抗病品种L.hirsutumG1.1560杂交后的F2代、F3代材料进行PAPD分析,把Ol-1基因定位在RFLP标记TG153和TG164之间。并且找到了与抗番茄白粉病基因紧密连锁的5个均为共显性RAPD标记,,并转化为SCAR01、SCAR10、SCAE16、SCAR11和SCAR16的SCAR标记,这有利于该基因的克隆以及番茄抗白粉病分子标记辅助选择系统的建立,这使得需要5至9次回交的传统育种方式完成的工作,只需2至3次即可完成,大大缩短了育种时间。Bai等(2003)利用Lycopersiconesculentumcv.×LycopersiconparviflorumG1.1601的杂交F2代群体和AFLP分析,找到了与抗性有关的3个位点。其中Ol-qtl1位于第6染色体上,与Ol-1位点在同一区域。Ol-qtl2和Ol-qtl3位于第12染色体上,二者相距25cM,与另一抗白粉病基因Lv距离较近。这对番茄白粉病的主要抗性和潜在抗性基因之间的关系提供了研究空间。1.4快速鉴别抗性基因pto番茄斑疹病(Pseudomonassyringacepv.tomato)是一种细菌性病害,危害极其严重。Martin等(1991)报道了利用RAPD技术和近等基因系RioGrande和RioGrande-Pto快速鉴别抗性基因Pto的研究。在此试验中,选用了144个引物,共产生了将近625种相互分离的扩增产物,获得R110、R120、CD41等三个标记,以最大似然估计得:R110与Pto之间距离为19.7±13.2cM。美国康乃尔大学农业与生命科学学院的Martin等(1993)报道了利用与Pto基因紧密连锁的这些标记和染色体步移技术,首次将Pto基因成功的克隆,并通过遗传工程方法将该基因转移至感病植株,使这些植株具有了天然抗病植株具有的抗性。1.5scr标记的筛选番茄斑萎病(Tomatospottedwiltvirus)是一种严重的番茄病害之一,通常引起番茄的茎和叶片的发育不良、坏死,造成植株死亡。而由野生番茄转移到栽培番茄中的Sw-5基因对番茄斑萎病具有明显的抗性。Stevens等(1995)利用近等基因系和一个普通番茄与潘那利番茄杂交的F2群体为材料,在748个随机的10寡聚核苷酸引物中筛选出1个随机引物(5′GAGCACGGGA3′),产生了一条约2200bp的条带,与Sw-5紧密连锁,并利用此标记将Sw-5定位于第9条染色体的长臂近端部位,两个标记CT71和CT220之间,图距间隔为2.7cM。Chague等(1996)报道了用BSA法和RAPD技术筛选与Sw-5连锁标记,找到了9个与Sw-5连锁的标记,其中标记R1和R2分别位与Sw-5两侧10.5cM的范围内,与Sw-5的距离均为1.1cM,并认为这两个标记都是因种间杂交随同Sw-5进入L.esculen-tum的。他们还把其中的R2改造成稳定的SCAR标记。Brommonschenkel和Tanksley(1997)利用这些与Sw-5紧密连锁的标记和染色体步移技术把Sw-5基因定位在100kb的范围内。1.6aflp标记的分析番茄叶霉病(Cladosporiumflulvum)是一种世界性的病害,严重威胁着番茄的生产,特别是在保护地内,随着种植面积的扩大和连作时间的延长,该病危害日趋严重。Thomas等(1995)利用AFLP技术在L.esculentum(Cf-9)XL.pennellii的F2世代中筛选了近42000个AFLP座位,获得了3个与Cf-9共分离的AFLP标记(M1、M2、M3),集中于Cf-9基因两侧共约0.4cM的范围内。对含有Cf-9基因克隆的质粒再用AFLP标记进行分析,得知M1和M2分别位于Cf-9基因的两侧,相距间隔为15.5cM。Jones等(1994)并以这些标记为起点,通过转座子示踪子技术将Cf-9基因克隆。1.7rapd标记的发现和应用番茄黄曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV),Czosnek等(1990)报道该病在地中海、北非和古巴的广大地区均有发生,造成番茄的大面积损失。Hanson等(2000)利用92个RFLP标记作为探针对来自野生番茄黄曲叶病毒病抗性基因Ty-1进行了定位分析,将其定位在第11染色体上,TG36和TG393两个标记之间,约14.6cM的范围内,这是首次对该抗性基因的定位报道。Chague等(1997)利用RAPD技术和BSA法,用600条引物找到了与Ty-1紧密连锁的四个RAPD标记,分别为Ra、Rb、Rc、Rd(450bp、800bp、400bp、1100bp),定位在17.3cM的范围内。自上世纪1950年发现番茄枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)以来,现已遍及世界各地,并成为番茄生产上的重要问题。目前番茄枯萎病的生理小种已发现3个:生理小种1、2、3。国外不少含I-1、I-2、I-3基因已被转入普通番茄中。Sarfatti等(1991)Lycopersiconpennellii×L.esculentum的回交群体,利用番茄第7条染色体RFLP的两个TG20和TG128标记之间的154个标记对I1基因进行了区域分析,为该基因的克隆奠定了基础。Sarfatti等(1989)对抗番茄枯萎病生理小种2的基因I2进行了分析,认为RFLP标记TG105与该基因紧密连锁(0.4cM)。而且Segal等(1992)利用RFLP标记TG26和TG36两个标记把I2定位在4.1cM的范围之间。并且根据这些与抗番茄枯萎病基因紧密连锁的分子标记已经把这些基因克隆。Kawchuk等(1998)找到了与抗番茄黄萎病(Verticilliumvaporariorum)基因Ve的4个共分离的RAPD标记(0.49到0.67cM之间)。Fazio等(1999)利用1000条10bp的随机引物筛选出与单一主效基因Frl(抗番茄茎根腐烂病)紧密连锁的UBC#116、194和655三个RAPD标记,其中UBC194与Frl相距5.1cM。Doganlar等(1998)获得了抗番茄根腐病(Pyrenochaetalycopersici)性基因py-1连锁的RAPD标记(OPW-4551和OPC-021420)。2番茄分子标记的应用研究数量性状基因位点QTLs(quantitativetraitloci)作图是对复杂抗病性状进行研究的有效方法。番茄分子标记连锁图谱的构建,为QTLs开展定位研究奠定了良好的基础。并且随着分子标记技术和QTLs作图研究的快速发展,越来越多的植物数量抗病基因(quantitativeresistanceloci,QRLs)得以鉴定和定位。近年来发表的有关番茄数量抗病基因的代表性研究主要有番茄晚疫病和番茄青枯病。现分述如下:2.1抗病品种和回交群体的扩增和图谱的构建番茄晚疫病(Phytophthorainfestans)是一种严重危害番茄生产的真菌性病害,培育抗番茄晚疫病品种是番茄稳产增产的有效经济手段。番茄的抗晚疫病是有两类不同的基因控制:一种受单显性Ph因控制;另受多基因控制,与多种因素有关,属数量性状。已在野生番茄中发现两个Ph基因(Ph1和Ph2)(Gallegly,1960;Moreauetal.,1998)。Chunwongse等(2002)利用感病品种CLN657(susceptible)和抗病品种L3708(resistant)杂交的F2群体对基因Ph-3进行标记,找到一个RFLP标记TG591(LOD=18.41)和两个AFLP,该基因与Ph和Ph-2为非等位基因。Moreau等(1998)利用Hawaii7996×WVa700杂交的F2代群体,把基因定位在标记CP105和TG233的8.4cM的范围内(第10条染色体的长臂上)。并利用BSA群体找到了与Ph-2连锁的AFLP标记。从而构建了Ph-2区域的高密度图谱,为该基因的图谱克隆奠定了基础。BrouwerandStClair(2003)等利用Lycopersiconesculentum×L.hirsutum杂交的回交群体为材料,对抗晚疫病Phytophthorainfestans有关的3个QTL(lb4,lb5b,和lb11b)进行了分析。分析表明,3个QTL位点基因组覆盖率为28～47cM,其中Lb4在标记TG609附近(TG182和CT194之间),第4条染色体上(6.9cM范围),Lb5b在标记TG69a和TG413TG609之间,第5条染色体上(8.8cM范围),与标记TG23距离最近,lb11b在标记TG194andTG400之间,第11条染色体上(15.1cM范围)。2.2rapd和fpss的扩增番茄青枯病(Ralstoniasolnacearum)是一种发生普遍、危害严重的土传性病害,其病原细菌可在土壤中存活多年,是热带、亚热带地区番