分子标记在烟草遗传育种中的应用

分子标记在烟草遗传育种中的应用

自20世纪80年代以来，随着分子杂交、pcr和dna序列快速分析等生物实验技术的建立，人们可以更容易地分析和检测遗传物质dna的多态性，并产生基于dna多态性的各种分子标记。与其他类型的遗传标记相比,分子标记的优点非常明显:(1)直接以DNA的形式表现,在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到,不受季节、环境限制,不存在表达与否的问题;(2)数量极多,遍及整个基因组;(3)多态性高,自然存在着许多等位变异,不需专门创造特殊的遗传材料;(4)表现为中性,即不影响目标性状的表达,与不良性状无必然的连锁;(5)有许多分子标记表现为共显性,能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型,提供完整的遗传信息。传统的烟草育种主要是通过常规杂交的方法,根据分离群体的形态表现和育种者的经验等进行累代选择,从而实现对目标性状的改良。而基因的表达往往受环境的影响,且多数情况下难以找到与目标基因相连锁的形态标记,所以传统的育种手段对目标性状的改良常常耗时、费力、效率不高。分子标记技术的发展为解决这一问题开创了新的途径。1草资源研究中的分子标记1.1rapd扩增鉴定遗传标记在种质资源研究中的重要用途之一就是绘制品种(品系)的指纹图谱。梁明山等采用水平切片聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测了7种同工酶的酶谱图式,筛选出的酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳酶谱(EST)可作为K326、云烟85、RG11、Val16、RG17、V2、云烟317、6465、红花大金元、NC82等10个烟草品种鉴定的同工酶指纹图谱;另外,K326、云烟85、RG11、V2、云烟317、6465、红花大金元、NC82种子的水溶蛋白SDS、IEF图谱可以作为鉴定这8个品种的蛋白质指纹图谱。FilippisLde等研究指出,利用形态标记和传统的生物学方法不能区分普通烟草或黄花烟草及它们的杂种,利用RAPD标记技术则可以将其区别开来。JCCoussirat等用160个引物对32个烟草材料的基因组DNA进行了RAPD分析,其中9个引物可以产生29条多态性带;通过聚类分析,可以把不同工业类型的烤烟、白肋和深色烟聚到不同的类群里,这为烟草种质资源的收集和育种提供了理论依据和技术支持。常爱霞等利用RAPD技术从500个引物中筛选出4个多态性引物,这4个引物扩增出的多态性片段可以作为鉴定大白筋599和G28两个品种的分子标记。LucaRossi等利用6对AFLP引物组合,在烟草品种K326、TN90、TN86和Samsun中扩增出了33个多态性标记。这些多态性标记可以很容易地将上述品种区分开来。对于像K326和TN90这样的烟草品种,即使是用调制后的烟叶作为材料,这些多态性标记仍可以将它们鉴别出来。1.2烟草种质资源的多样性姬广海等研究指出,遗传多样性是生物多样性研究的核心,它可反映出物种的遗传背景、育种潜力和利用价值,遗传多样性研究对优异种质的保护和发掘利用具有重要意义。NRen,MPTimko等利用AFLP标记技术对46个烟草栽培种和7个烟草野生种进行遗传多样性分析,结果表明,利用AFLP技术结合地理来源和调制类型可以将46个栽培种分为6类,栽培种的遗传多样性低,而7个野生种的遗传多样性比较丰富;另外,多态性谱带显示,普通烟草栽培种中都至少具有N.sylvestris、N.tomentosiformis或N.otophora的一个特征谱带,这表明普通烟草N.tabacum的起源与这3个野生种有关。许明辉等对来源于中国、美国等国家的23个烤烟和地方晒晾烟品种进行了RAPD分析,并将其划分为6类,各类中包含有不同地理来源和不同调制类型的品种,这与以往人们对这些品种的认识有一定的不同,说明品种地理来源和调制类型差异与遗传差异没有必然的联系。因此育种实践中亲本选配时不仅要考虑双亲的地理来源、调制类型,同时也应考虑亲本的系谱、遗传差异等。王志德等对24个不同类型烟草核心种质进行了RAPD分析,结果表明,种质间的遗传差异并不完全取决于栽培类型间的差异,而与种质间演化关系有关。王涛等利用RAPD和ISSR标记技术对30份烟草种质资源进行了遗传多样性分析,研究显示,野生种和栽培种之间存在较大遗传差异;亲缘关系的远近与其遗传相似性有关,而与烟草栽培种的调制类型差异无关。这与许明辉等和王志德等的研究结果一致。杨本超等利用ISSR和IRAP技术对119份烟草种质资源进行了多样性研究,结果指出在各种烟草类型中野生烟的平均杂合度和多态性位点率最高,香料烟最小;从总体上来看,除黄花烟与其他各类型的遗传距离较远外,我国烟草各类型间遗传一致性较高,遗传多样性较低,遗传基础狭隘。2该菌株在草抗病性育种中的应用2.1优化植物的抗病品种目前,危害烟草的病毒病主要是烟草普通花叶病(TMV)、黄瓜花叶病(CMV)、烟草蚀纹病(TEV)、马铃薯Y病(PVY)、烟草环斑病(TRSV)。其中烟草普通花叶病、黄瓜花叶病和马铃薯Y病是当前生产上发病率较高、造成损失较大的3种病害。1985年,Sanford和Johnston提出病原体引发抗性(Pathogen-derivedresistance,PDR)的概念。1986年,PowellAbel等将烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草,获得第一例抗TMV转基因植株。自此以后,植物抗病毒基因工程获得迅速发展,已成为解决植物抗病毒病害的主要手段。植物抗病毒基因工程研究主要包括2个方向,其中一个方向是将病毒本身的基因导入受体植物,获得抗性植株;另一个方向是将非病毒来源的基因,如植物中自然存在的抗性基因或植物、微生物的核糖体失活蛋白(RIPs)基因等导入受体植物,获得抗病毒植株。美国KoellentG等研究表明,烟草PVY抗源主要集中在栽培品种VirginA的突变体VirginAMutant(TI1406)上,其对PVY的抗性被认为由隐性单基因(va,va1,va2等)控制,抗PVYO(commonstrains)普通株系。另一个栽培品种Enshu(TI1586)抗PVY的弱毒株系,但对其强毒株系不抗。SNoguchi等对感PVY品种BY4及其近等基因系F55进行RAPD分析,利用筛选出的多态性引物对其F2群体进行分析,找到了10个RAPD标记,遗憾的是这些标记只在感病品种中存在,在抗病品种中不存在。Southern杂交也证实了这些标记的序列在抗病品种中不存在,而存在于感病品种中,从而认为va基因位点的抗性是由于对PVY感病基因Va位点的缺失。通过在植物体内表达马铃薯Y病毒属基因组序列如P1、P3、CI、VPg、NIa、NIb、CP等,目前人们已获得了多种抗病毒的转基因植物。白庆荣等将非翻译马铃薯X病毒的衣壳蛋白(PVX-CP)基因和非翻译马铃薯Y病毒的外壳蛋白(PVY-CP)基因组成嵌合基因,构建植物表达载体pROKXY,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,获得6株对PVX和PVY的混合侵染表现为免疫的转基因植株。分子分析表明,这种抗性为RNA介导的病毒抗性。张凯等将烟草普通花叶病TMV的部分运动蛋白基因通过农杆菌借导法转化烟草品种云烟87,获得了50株转基因烟草,PCR和Southern分析表明基因已整合到烟草植株的基因组内。转基因烟草对TMV的抗性包括3种类型:免疫型5株,抗病性2株,感病性43株。2.2烟草抗真菌病近年来,烟草真菌、细菌性病害对烟叶生产的危害越来越严重,与抗病毒病研究相比,烟草抗真菌、细菌性病害研究要落后的多,但也取得了一定的进展。2.2.1抗根黑腐病基因的扩增烟草根黑腐病是一种普遍的土壤真菌性病害,在烟草栽培种中有些材料只对该病有部分抗性,而烟草的近缘四倍体N.debneyi对根黑腐病具有广谱抗性。BaiD等对N.debneyi和普通烟草Delgold创造的抗根黑腐病的二体和单体异附加系进行了RAPD分析,结果显示,带有抗病基因的染色体是来自N.debneyi;然而,大多数情况下,普通烟草的遗传背景明显阻碍了同源染色体的配对,这也引起染色体联会的消失,但有时来自于N.debneyi的染色体也可以和普通烟草染色体配对。这使得将带有抗病基因的染色体片段转移到普通烟草,培育出抗根黑腐病品种成为可能。BaiD等利用441个引物对烟草品种Delgold和它的具有来自N.debneyi的抗根黑腐病基因的近等基因系以及抗根黑腐病品种PB19进行了RAPD分析,发现标记在Delgold和其近等基因系间的多态性比较低,最后仅找到2个与烟草根黑腐病抗性基因紧密连锁的RAPD标记。KenwardRD等将与该抗性基因紧密连锁的RAPD标记UBC4181050克隆测序,分离出了与抗性基因连锁的标记Tnd-1。2.2.2rapd标记刘晓侠等通过辐射诱变获得了高抗烟草黑胫病的突变株系,将突变抗病株系与感病品种红花大金元进行杂交得到F2分离群体,然后利用RAPD标记和群体分离分析法(BSA),找到了与烟草抗黑胫病基因Bsl(t)连锁的RAPD标记OPT023000和OPM112500,其遗传距离分别为20.5cM和29.9cM。JohnsonES等的RAPD分析结果表明来自白花丹叶烟草(N.plumbaginifolia)的黑胫病抗性基因和来自长叶烟草(N.longiflora)的黑胫病抗性基因是等位基因,并且这2个基因位点能发生重组;他们用BSA法找到了与烤烟品种Coker371Gold中黑胫病抗性基因Ph连锁的RAPD标记,并证明所得到的标记可以有效应用于对Ph基因的分子标记辅助选择育种中。张锦伟等采用SMART技术构建了抗黑胫病烟草品种K326的cDNA文库,为抗黑胫病基因的分离、筛选和克隆奠定了基础。2.2.3白肋烟抗病品种的aflp扩增烟草青枯病是一种严重危害烟草生产的土壤细菌性病害,在我国长江以南的烟区普遍发生。人们对烟草青枯病抗性的遗传机制进行了较多研究,但关于该抗性基因的个数,却未形成一致意见,一种观点认为该抗性由多基因控制,另一种观点认为由显性单基因控制。目前,根据抗性来源不同,人们将烟草青枯病抗性分成两种情况,其中,来源于T.I.448A和DSPA的抗性是由多基因控制;而来源于SumatraC和Xanthi的抗性则是由显性单基因控制。Matsuda认为烟草品种Hatano,Kokubu,Odaruma和Awa具有青枯病抗性基因Rps,而品种Enshu和Hatanodaruma不但具有青枯病抗性基因Rps还具有其他抗性基因。NishiT等利用白肋烟抗病品种W6和感病品种Michinoku1配制杂交组合,进行了AFLP分析。AFLP引物在亲本间共扩增出117条多态性带,利用多态性引物对125个杂种一代进行作图,建立了包括10个连锁群的连锁图谱,其中与青枯病抗性有关的一个QTL被定位在一个连锁群上,包括15个分子标记,长32cM,此QTL对抗性的贡献率为30%。杨友才等选用高感青枯病品种红花大金元与高抗青枯病品种Ti448A配制杂交组合,依据群体分离分析法(BSA)进行RAPD分析,从近200个随机引物中筛选出一个多态性引物S503,实验证明该引物扩增出的特异性片段S503-750是一个与抗青枯病基因连锁的RAPD标记,此标记与抗性基因间的重组率为5.984%,连锁距离为6.261cM。2.2.4rapd标记的筛选YiYH等以白肋烟感病品种NC528和抗病品种Ky14以及烤烟感病亲本Coker139和抗病亲本SpeightG-28为材料,利用BSA法进行了烟草野火病抗性基因的RAPD标记。结果得到5个与抗性基因连锁的RAPD标记。徐秀红等以含有来源于长叶烟草(N.longiflora)的抗病基因的品种Ky14和感病品种SpeightG-140为亲本,利用BSA法对抗病基因进行RAPD分析。从423个引物中筛选到1个与抗病基因紧密连锁的RAPD标记S522000,标记与基因间的遗传距离为4.88cM;用标记S522000对[(SpeightG-140×Ky14)×SpeightG-140]BC1群体进行辅助选择和验证,结果表明,这个标记可有效用于来自长叶烟草野火病抗性基因的检测和辅助选择。2.3栽培品种的筛选烟草抗根结线虫病的育种始于20世纪30年代,目前已培育出一些抗病品种如NC95、NC587、SpeightG-117、SpeightG-80等,这些品种对南方根结线虫病1号和3号小种具有抗性。目前尚没有培育出兼抗南方根结线虫病和爪哇根结线虫病的栽培品种。N.repanda对爪哇根结线虫病免疫,但是不易与红花烟草杂交。YiYH等以抗根结线虫病白肋烟品种NC528和感病品种Ky14为材料,利用RAPD标记绘制了抗根结线虫病1号和3号小种基因(Rk)的连锁图谱,其中16个RAPD标记被定位在图谱的6个位点上,总长24.1cM,这为根结线虫病抗性基因的克隆奠定了基础。王扬等对12个烟草品种(包括烤烟和晾晒烟)进行RAPD分析,结果发现OPJ13能够在烤烟、晾晒烟所有感病品种中扩增出一条780bp的DNA片段,而在所有抗病品种的扩增产物中均未发现该片段。由于目前抗根结线虫病烤烟品种的抗源均来自原始抗病亲本TI1706,因此OPJ13-780极有可能是与烟草感病基因相连锁的分子标记。3问题和期待3.1加强标记应用,提高育种效率3.1.1目前在烟草中应用的分子标记大部分为RAPD标记,而近年来发展起来的新型分子标记在烟草中的应用较少,所以应大力开展新型分子标记在烟草中的应用研究,建立并优化相应的分子标记应用体系,为烟草研究提供更为精确的遗传标记。3.1.2在烟草有益基因已有分子标记中,标记和目的基因间的遗传距离普遍较大,难以有效应用于育种实践,且与目的基因完全连锁的标记少,影响基因检测的准确性。因此,应进一步筛选紧密连锁或共分离的标记,以准确地检测有益基因,提高育种的选择效率。3.1.3目前各种分子标记技术均有不同程度的缺点,这使得大规模应用分子标记技术辅助选择育种受到一定限制,所以今后应开发共显性、多态性高、重复性稳定性好、简单易用、自动化程度高的新型理想分子标记技术,为普及应用分子标记辅助选择(MAS)提供技术支持。3.2价格补充3.2.