乳酸菌作为基因工程菌的研究进展

乳酸菌作为基因工程菌的研究进展

蘑菇是一种常见的革兰氏阳性厌氧菌，可以发酵养分（主要是葡萄糖），主要包括肠球菌、乳菌、明珠菌、杆菌、球形细菌和双叉菌。传统乳制品制作有着几千年的历史,其中的乳酸菌是重要的可利用生物资源,乳球菌和乳杆菌的许多种通常是被认为具有安全(Generally-regarded-as-safe,GRAS)的特性,是一种食品级的微生物。在过去的20年里,LAB的特性、新陈代谢、种类、遗传特性等方面的研究逐步增加,近几年,LAB在基因工程领域有了很大的发展,包括内源性质粒的去除、电穿孔方法的建立等,已建立了一系列具有不同用途的选择标记和突变系统等,以及LAB的模式菌Lactococcuslactis的基因组的测序完成,这些都为LAB在食品、医药工程方面的应用提供了可能,而食品级的高效表达系统的构建和应用更是近年来的研究热点。1菌株的致病性乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌,已证明其在食品工业各个领域中的长期应用不具有致病性,目前主要以乳酸球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌作为基因工程菌。1.1乳酸球形蛋白检测乳酸球菌是乳酸菌中的典型菌种,乳酸球菌作为基因工程菌有其独特的优势:首先,乳酸球菌是无强抗原性;其次,乳酸球菌本身分泌蛋白较少,Usp45是迄今已知乳酸球菌分泌的唯一可检测蛋白,减少了载体表达的自身蛋白对外源分泌蛋白的干扰;第三,乳酸球菌不产生任何细胞外蛋白酶,不会引起分泌蛋白发生细胞外的降解。但是乳酸球菌基本不在胃肠道内定植,因而不能长期持续分泌外源蛋白。1.2尿激酶iga的制备乳杆菌为棒状、厌氧或微厌氧的革兰氏阳性、非致病菌,能在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植,对维持微生态平衡具有重要作用;作为基因工程菌可简化表达产物的后期处理工艺;同肠胃外免疫途径相比,可通过黏膜免疫诱发IgA产生;具有免疫佐剂作用及对胆汁酸的抵抗力,因此乳酸杆菌作为基因工程受体菌的应用前景十分广阔。1.3双歧杆菌穿透载体双歧杆菌作为基因工程受体菌的研究相对较少,Sgorbati等对1461株共24个种的双歧杆菌进行了质粒的检测,发现4个种的双歧杆菌即长双歧杆菌、球双歧杆菌、星状双歧杆菌及印度双歧杆菌含有质粒。Missich等成功地构建了1个大肠埃希菌-长双歧杆菌的穿梭载体,将该重组质粒分别转化大肠埃希菌和双歧杆菌,均筛选到重组子,说明该重组质粒为穿梭载体。大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭载体的成功构建,将为今后双歧杆菌遗传分子机理的研究和基因工程菌的研制提供有力的工具。2抗性基因传统的乳酸菌载体为保持一定的选择压力都带有一个或多个编码特定抗生素(红霉素、氯霉素)抗性的基因,由于抗性因子具有可转移性,将其释放到环境或被人或动物摄入体内会带来严重的生物安全性后果,美国FDA早已禁止在食品中使用此类标记。目前,已开发出应用于乳酸菌的非抗生素抗性选择标记,主要有3类:糖类选择标记、细菌营养缺陷型标记以及编码细菌素抗性的标记。2.1lacf基因缺失菌株的构建糖类利用选择性标记包括乳糖、蔗糖、木糖、蜜二糖等。目前,在乳酸菌的糖类利用中,以乳糖操纵子研究得最为深入。Maccormick等将完整的乳糖操纵子插入到无质粒的乳酸乳球菌MG5276的染色体中,然后通过双交换同源重组使LacF基因失活,细菌表型为Lac-,当将克隆有LacF基因的质粒导入LacF缺陷株时,细菌就恢复了Lac+表型,并可以通过含乳糖指示剂的溴甲酚紫平板来筛选重组菌落。当使用含乳糖的培养基时,这种含LacF基因的质粒稳定地存在于乳酸乳球菌中而起到选择性标记的作用。此外还可利用乳酸菌具有发酵特殊糖类的表型特征构建新的食品级载体,蜜二糖是乳酸菌的一个特殊的发酵底物,Labrie等利用棉子糖乳球菌的aga基因的Mel+表型特征开发了新的选择标记。2.2规划系统中nd-pcr扩增Dickely等构建了一个乳酸菌食品级载体pFG1,它由乳酸乳球菌一个质粒的最小复制子、乳球菌的赭石突变抑制基因supB及一段人工合成的含有11个限制酶切位点的多克隆位点组成,载体大小约2kb。当乳酸乳球菌嘌呤生物合成途径中的基因发生赭石突变时,表现为嘌呤营养缺陷型。而pFGl载体中的supB基因产物可以抑制这种营养缺陷型,因此supB基因可作为选择标记。但是pFG1在工业菌株中却很不稳定,Sorensen等在pFGl的基础上构建了一个新的食品级表达载体pFG200,pFG200以琥珀突变抑制基因为选择标记,并且除了一小段多克隆位点外全部由乳球菌DNA构成,在不含嘧啶培养基中可有效地选择和保持含克隆载体的菌株。2.3nisin生物合成在食品级载体中使用的细菌素抗性标记主要是乳链菌肽(Nisin),Nisin是乳酸乳球菌中某些菌株产生的小肽,对人体安全无毒,是天然的食品保藏剂。Nisin的生物合成涉及到nisin基因簇的nisZ/ABTCIPRKFEG的11个基因,以及nisA、nisR、nisF基因前的3个启动子。Takala等构建了一个包括pSH71的复制子、选择性标记nisI基因以及启动子P45食品级克隆载体pLEB590,并在L.lactis成功地表达了来源脯氨酸亚氨基肽酶的基因pepi。3蘑菇的出现系统3.1乳状液发生突变可能引起大肠杆菌t7rna聚合酶基因表达乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的乳糖诱导表达系统是其LacA启动子不受乳糖分解代谢物阻遏,而是受到自我调节的LacR阻遏物控制。LacA强启动子是由乳糖在细胞内的分解代谢物转变成了中间代谢物6-磷酸塔格糖(tagatose-6-phosphate),使LacR阻遏物激活而造成的。把大肠杆菌T7RNA聚合酶基因连接在LacA启动子后,该基因的表达受到乳糖的调节。戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)的xyl基因受到木糖诱导,把无启动子的cat-86基因连接在xylA基因的启动子下,转化到戊糖乳杆菌中表达,分别以含有木糖和葡萄糖培养基上培养,CAT表达量差别很大,前者表达的CAT活性比后者高出60~80倍。3.2乳酸乳球形保鲜将LacZ作为报告基因放在ψ31启动子后面,构建成质粒后转入乳酸乳球菌中,被ψ31噬菌体感染后,产生大量的β-半乳糖苷酶,质粒在未被噬菌体ψ31感染前在宿主菌内是低拷贝的,而一旦被感染后,1~2h内基因的表达量可以增加1000倍以上。3.3细胞外有乳链球菌素乳链球菌素表达系统(nisin-controlledexpression,NICE)是乳链球菌素表达系统典型的代表,当细胞外有乳链球菌素时,具有传感蛋白作用的NisK能够识别乳链球菌素,使NisR磷酸化去激活nisA启动子,导致下游基因的表达,这种小肽信息素依赖的调节系统在革兰阳性菌中广泛存在。该系统表达的产物可以达到细胞总蛋白的10%~60%,产量提高数千倍。Sorvig等在该系统基础上建立了诱导性乳酸杆菌表达系统。3.4丝裂霉素对rro基因和tec基因表达的控制由于对乳酸杆菌温和噬菌体ψorlt基因全序列的测定,分析发现了一个与溶原转变有关的调控区。它由与转录方向相反的2个基因启动子(P1和P2)组成,分别控制rro基因(编码一个阻遏物)和tec基因(编码Cro的拓扑异构体)的表达。P2的表达受到Rro阻遏,加入丝裂霉素可以缓解这种阻遏。通过设计一个热不稳定性的Rro的阻遏变异体Rrol2,构造了温控表达系统,将乳酸杆菌生长温度从24℃提高到42℃时,使P2控制的外源蛋白表达量有了很大的提高。4可混养成分配产品随着基因工程技术的不断发展,各种乳酸菌食品级基因表达系统也得到了进一步开发和应用,有助深入了解乳酸菌的基因功能和表达调控的规律。通过改造乳酸菌使其更适宜人体的需要,制成微生态制剂和活菌疫苗等保健品或药品,是LAB分子生物学研究的一个重要方向。同时,可