糖尿病模型小鼠血糖变化与肠道菌群关系的研究

糖尿病模型小鼠血糖变化与肠道菌群关系的研究

肠道中的大多数微生物都在人体。乳酸杆菌和双歧杆菌是肠道内正常微生物群系中重要成员并与宿主终身相伴。肠道菌群可发挥特异性免疫功能,促进宿主B细胞产生抗体的能力;合成多种维生素,促进机体对蛋白质的消化、吸收;促进机体对钙、铁、维生素D的吸收等生理功能。目前在研究糖尿病发生,发展时,对于正常菌群的多样性和生理功能在维持机体血糖中的作用,以及肠道菌群与血糖值之间的相互关系的研究较少。为此,我们通过建立糖尿病小鼠模型,比较成模前后,以及降糖物质作用后,血糖值和肠道内主要微生物的变化,探讨二者的关系,希望为糖尿病的控制和预防提供新的思路和理论依据。1材料和方法1.1糖试纸条和格列吡嗪片电子天平:BL310(北京奥多利斯仪器系统有限公司);京都血糖仪(日本,ARKRAYInc.);血糖试纸条:GlucocardTMTestStripⅡ(日本,ARKRAYInc.);STZ(Sigma公司);格列吡嗪片(海南金晓制药有限责任公司);蕃石榴叶提取液(自制);稀释液(0.5ml,0.5%L-半胱氨酸;1.0ml,吐温80;0.5g,酵母粉;1000ml,水;pH7.0～7.2)。1.2医学科学中心提供40只清洁级昆明小鼠(18～22g),雄性,由四川省医学科学院实验动物中心提供(医动字第24101106号)。四川大学华西公共卫生学院屏障级实验动物中心,室温20土2℃,湿度50%～60%,自由进水,12h光照。1.3造模、分组和给药小鼠空腹18h,腹腔注射STZ(80mg/kg),72h后以相同剂量加强注射1次。以血糖值>11.1mmol/L为造模成功标准。将40只小鼠随机分为3组:第1组:10只,小鼠不经特殊处理(蒸馏水灌胃);第2组:15只,造模成功后,用蕃石榴叶水提取液给小鼠灌胃;第3组:15只,造模成功后,用格列吡嗪片给小鼠灌胃。1.4小鼠血糖含量测定腹腔注射STZ的7d测定血糖,如造模成功(成模时),即计为1d的血糖值:禁食3～5h,取小鼠尾静脉血,用血糖仪测血糖值;造模成功后,使用降糖物质(以1.25g/Kg计)连续灌胃25d,同前法测定25d的血糖值。同时,用电子天平称取1、5、10、15、20、25d小鼠的体重。1.5培养基的制备乳酸杆菌:LBS培养基,37℃48h烛缸培养;双歧杆菌:BBL培养基,37℃48h厌氧培养;梭菌:TSC培养基,37℃48h厌氧培养;肠球菌:叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基,37℃48h需氧培养;真菌:YPD培养基,37℃48h需氧培养;肠杆菌:EMB培养基,37℃24h需氧培养。EMB、TSC培养基购自北京陆桥技术有限责任公司,其余培养基均自行配制。测定血糖值后,以无菌方法取小鼠的新鲜粪便0.1g,置于无菌试管内,按1∶10加入适量稀释液,用无菌玻棒搅匀后,置振荡器上充分振荡,使其均质化。依次进行10倍稀释。选择适宜的稀释度,滴种于培养基上,分别进行需氧和厌氧培养,最后计数菌落,结果以每克粪便中的细菌菌落数的对数值logcfu·g-1表示。1.6统计处理使用SPSS11.0进行统计分析,以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示结果,采用单因素方差分析进行统计处理。2结果2.1小鼠体重及总增加的发生率从测定体重1d(成模时)开始到25d(降糖后)结束,第1组小鼠体重的总增加的较其他组明显。第2、3组小鼠体重的差异无统计学意义(P>0.05)。在15、20、25d,第1组与第2、3组小鼠的体重的差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。(体重数据略)2.2小鼠血糖值的比较第1组小鼠血糖值随时间无明显变化(F=1.920,P>0.05);成模时,第2、3组小鼠的血糖值明显高于第1组(P<0.05);使用降糖物质处理后,第2、3组小鼠的血糖值比成模时显著降低(P<0.05),但是两种降糖物质对小鼠血糖值的影响差异无统计学意义(P>0.05),见表2。2.3大鼠肠道菌群的变化2.3.1前后与成模时的统计学处理情况除了肠杆菌外,所测小鼠其它肠道细菌数量在小鼠造模前与成模时相比有统计学意义(F=12.623～80.217,P<0.05)。其中乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌数量减少,而肠球菌、真菌数量增加,见表3。2.3.2小鼠肠道菌群变化第1组小鼠的肠道所测菌株无显著性变化(F=0.334～1.696,P>0.05);血糖降低后,第2、3组小鼠的肠道乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌的菌数在25d恢复到了造模前的水平,而肠杆菌、肠球菌、真菌的菌数在实验过程中呈递增(在25d,肠杆菌较成摸时变化明显(F=6.069,P<0.05)),见表3。2.4经过处理后，大鼠血糖变化与肠道菌群之间的关系2.4.1各微生物的、小值成模时,血糖值升高到极大值时,双歧杆菌、乳酸杆菌、梭菌的数量达极小值,真菌、肠球菌、肠杆菌反而增加;经降糖物质处理后,血糖值降低,双歧杆菌、乳酸杆菌、梭菌的数量恢复到造模前的水平,真菌、肠球菌、肠杆菌则继续增加,见图1。2.4.2格列吡咯处理后的情况所测各菌种菌数的变化情况同2.4.1,见图2。3降糖药的使用效果STZ能抑制体内胰岛素水平,使维持血糖平衡的能力显著降低,与非胰岛素依赖型糖尿病病人高血糖值情况相似。小鼠成模后出现明显“三多一少”和血糖值升高的现象,模型成功模拟了人类糖尿病的发病规律。本次试验第2、3组体重比第1组体重明显偏低,血糖值均大于11.1mmol/L,说明造模是成功的。据资料报道,蕃石榴叶可以除异味,常被人们作为“糖尿”病者日常保健饮料。通过实验比较蕃石榴叶水提取液、65%醇提取液、95%醇提取液,发现蕃石榴叶水提取液对糖尿病模型小鼠的降糖效果好。格列吡嗪作为治疗糖尿病的辅助措施,属于第二代磺酰脲类口服降血糖值药,不良反应常为胃肠道症状(如:恶心、上腹涨满)及头痛等。采用格列吡嗪与蕃石榴叶水提取液作为不同降糖物质代表,通过它们的降血糖作用来研究血糖与肠道菌群的关系,未查见相关报道说明它们直接对肠道菌群产生影响。但本实验发现不同的降糖物质均可使小鼠血糖值和益生菌趋于正常。是否可通过改变益生菌的变化,作为治疗糖尿病的手段有待进一步深入研究。双歧杆菌直接或间接影响着人和动物的生理变化和免疫功能,它在机体内的有无或多寡是衡量健康状况的指标之一。乳酸杆菌可减少或消除体内毒素和致癌物质,保护胃肠粘膜,预防便秘,预防和治疗腹泻等。单核/巨噬细胞、激活的T、B淋巴细胞表面有胰岛素受体。外源性微生物侵入体内后,免疫系统把信息传递给大脑和神经-内分泌系统,从而进行调节。有文章报道,利用双歧杆菌,乳酸杆菌或它们的制剂,可以使肠道内益生菌增加,对小鼠肠道菌群失调的恢复具有调整作用。所以,糖尿病病人可以在使用降糖药物的同时,可以通过调整肠内菌群来巩固和提高疗效,增强免疫力,减少并发症。小鼠血糖与肠道菌群逐渐趋于正常,主要表现是血糖值得到控制和双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌的数量恢复到正常范围。某些条件致病菌,如大肠杆菌、肠球菌、真菌等,亦呈递增的趋势,与血糖变化趋势不明显。这可能与大肠杆菌、肠球菌、真菌易耐药和供给小鼠的食料的营养结构失调或不良等因素有关。饲料中如没有维生素K(可导致小鼠患有出血性综合症),大肠杆菌就能够合成维生素K,这是其可能递增的原因。研究发现,无论病人或实验动物,在肠道内或其他部位的肠球菌的数量会因抗生素使用而增加。但是,需要进一步论证当血糖稳定到正常值时,条件致病菌是否也应恢复到正常范围。肠道菌群能够提供宿主营养,参与宿主免疫调节,具有生物拮抗等作用。双歧杆菌、乳杆菌等能够产生乳酸,在一定程度上抑制病原菌,但在肠道内繁殖速度较慢,而肠杆菌、肠球菌、真菌在肠道内繁殖速度较快,当体内的优势菌群(双歧杆菌、乳杆菌等)生长受到抑制或生长缓慢时,它们占据主导地位。当血糖值偏高时,益生菌、梭菌等偏低。降糖处理后,血糖降低,益生菌、梭菌等趋于正常水平,从而表现出益生菌、梭菌等肠道菌群的变化趋势与血糖变化呈负相关。说明在疾病发生发展过程中,机体的微生态平衡也发生相应的调整,因此,通过对肠道益生菌和条件致病菌进行人为的控制,是否能够预防和辅助治疗糖尿病,需进一步研究证实。STZ是一种抗菌素,有腹泻、消