egcg对环磷酰胺诱导小鼠精子畸形的影响

egcg对环磷酰胺诱导小鼠精子畸形的影响

近年来，污染、职业接触、工作压力、生活习惯等因素可能导致移植率增加，导致精神素质下降。而饮茶是很多国人的生活习惯,我国已有几千年的茶道历史。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)是茶中含量最高的一种儿茶素类化合物,占儿茶素类化合物的50%~60%。EGCG具有良好的抗突变、抗肿瘤、抗氧化作用等。所以,本实验以小鼠为动物模型,利用环磷酰胺处理小鼠,诱导雄性小鼠精子畸形率增加,同时给予EGCG灌胃处理,探究EGCG对小鼠精子畸形的影响,评价EGCG对于雄性配子是否有保护作用。1材料和方法1.1联邦公司产品及号注射用环磷酰胺,江苏恒瑞医药股份有限公司生产,批号:403501。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG):纯度≥95%,杭州和田生物技术有限公司提供,批号:20071123s。1.2ecgg的灌胃方法将小鼠随机分成8组,每组8只。阴性对照组:灌胃和腹腔注射生理盐水。阳性对照组:生理盐水灌胃,以30mg/kg环磷酰胺腹腔注射。不同剂量EGCG组:腹腔都注射生理盐水,然后分别以20、40、80mg/kgEGCG灌胃。不同剂量EGCG抗环磷酰胺诱导组:腹腔注射30mg/kg环磷酰胺,然后分别以20、40、80mg/kgEGCG灌胃。按照体重给予受试物,体重相同的小鼠所给予的试剂体积一致。采取隔日给药,连续处理5d。灌胃前至少禁食6h,不禁水。每次先注射后灌胃,相隔至少3h,每日观察并记录小鼠的生活状态。1.4精子悬液的制备分别在首次给药后4周和5周,每组随机挑选3只健康小鼠,用颈椎脱臼法处死,取双侧附睾,放入5ml37℃预热的生理盐水中充分剪碎,通过4层擦镜纸过滤除去组织碎片,制成精子悬液,参照Wyrobek方法制片,涂片。待干燥后,无水甲醇固定5min,1%伊红染色30min,双蒸水冲洗多余染液,自然干燥后置于400倍显微镜下观察形态。每只小鼠观察1000个头、尾完整的并且不与其他精子重叠的精子,按无钩、无定形、香蕉形、胖头和双头双尾分别记录畸形精子数,并计算每组小鼠的精子畸形率。精子畸形率(%)=畸形精子总数/检查精子总数×100%。1.5数学模型的显著性分析采用Excel和SPSS17.0软件的ANOVE过程进行单因素方差分析,显著性检验采用LSD法多重比较,结果以ue0af±s表示。当P≤0.05时为差异具有统计学意义。2结果2.1小鼠畸形精子类型观察见图1。精子畸形一般分为头部畸形、颈部畸形、中段畸形、主段畸形四大类。正常的小鼠精子头部如镰刀状,顶端有小勾(如A)。小鼠畸形精子类型主要包括无定形头、香蕉头、胖头、无勾、双头、双尾。无定形头、香蕉头、胖头、无勾、双头为头部畸形,双尾为尾部畸形。实验中观察到头部畸形较多,尾部畸形较少。头部畸形中以无定形居多。2.2精子畸形率测定见表1。EGCG各剂量组诱发的精子畸形率与阴性对照组相比,无显著性差异(P>0.05);EGCG各剂量组诱发的精子畸形率又显著低于阳性对照组(P<0.05)。阳性对照组精子畸形率显著性高于阴性对照组(P<0.05)。CP+各剂量EGCG组的精子畸形率分别与阳性对照组比较,具有显著性的差异(P<0.05)。而CP+80mg/kg组的精子畸形率显著低于生理盐水对照组和CP+20mg/kgEGCG组(P<0.05),但是与CP+40mg/kgEGCG组相比没有显著性差异(P>0.05)。2.3两组精子畸形率的比较表1见表2。EGCG各剂量组诱发的精子畸形率显著低于阴性对照组生理盐水组(P<0.05),阳性对照组精子畸形率显著性地高于阴性对照组(P<0.05)。CP+各剂量EGCG组的精子畸形率不仅都显著低于阳性对照组(P<0.05),而且又显著低于阴性对照组(P<0.05)。2.4不同剂量ecgg组的精子畸形率见图2。两个不同时间的生理盐水对照组相比较,没有表现出差异显著性(P>0.05);两个阳性对照组也没有明显差异(P>0.05),这表示阴性对照、阳性对照在时间上并没有显著差异性。第4周检验的不同剂量的EGCG组的精子畸形率都显著高于第5周检验的不同剂量的EGCG组(P<0.05)。而第5周检验的CP+20mg/kgEGCG与CP+40mg/kgEGCG组的精子畸形率低于对应第4周检验的的精子畸形率,差异显著(P<0.05)。3ecgg对cp诱导小鼠精子畸形的作用精子畸形是指精子的形态异常和异常的精子数目增多。在正常的情况下哺乳动物的精液中也会存在一定数量的畸形精子,但是一旦有可引起生殖细胞遗传性损伤的化学物质作用于雄性动物时,畸形精子的数量会大大增加。精子畸形率的上升可能是由于DNA损伤。我们通过检查雄性动物接触化学物质后精子畸形率的高低,来判断该化学毒物的生殖毒性和对生殖细胞潜在的致突变性。一般认为精原细胞后期或者初级精母细胞早期对化学诱变剂较为敏感,在首次给药4~5周一次性获得精子畸形率较高,本试验采用连续五次给药以确保结果有较好的重现性。然而目前采用的5d连续给药过程易使小鼠产生较为强烈的应激反应和机械损伤,导致死亡率较高。所以本次实验采用隔日给药的方法,小鼠死亡率低于预实验。环磷酰胺是一种较强的烷化剂,它可以明显引发雄性动物精子畸形率上升,在小鼠精子实验中常作为阳性对照。虽然它引发的雄性动物性腺损伤的机制尚未明确,但是现在已经有许多研究表明可能是由于CP影响了体内组织的氧化还原的平衡,诱发氧化应激反应,从而对DNA等遗传物质造成损伤。本研究结果表明EGCG能够显著抑制CP诱发的小鼠精子畸形。这很可能是因为EGCG具有很强烈的抗氧化、抗自由基的作用。有研究证明EGCG的抗氧化性不仅高于其他儿茶素类化合物,而且其消除氧自由基的效率是维生素C的67倍。EGCG能消除体内自由基,对超氧阴离子自由基的清除率达98%,对自由羟基的清除率达99.3%~99.97%。而且EGCG提高体内自由基消除酶如过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD)活性,从而减少了活性氧簇(ROS)的积累和由此所致的DNA损伤。Spinaci等在体外进行研究发现在猪体外受精过程中添加EGCG可以减少精子产生过氧化氢,而且添加10μm/mlEGCG可以明显增加受精率。这也说明EGCG可能是通过抗氧化作用、减少自由基来降低CP的毒性作用。本研究显示,给药后第4周和第5周,阳性对照组小鼠精子畸形率显著性地高于阴性对照组,造模成功。而CP+各剂量EGCG组的精子畸形率分别与阳性对照组比较,具有显著性的差异(P<0.05),说明EGCG能抑制CP诱发的小鼠精子畸形。给药后第5周时,CP+各剂量EGCG组的精子畸形率不仅都显著低于阳性对照组(P<0.05),而且又显著低于阴性对照组(P<0.05),说明EGCG能够抑制CP诱发的小鼠精子畸形,而且具有明显的改善作用。同时研究发现EGCG对于小鼠精子畸形的作用存在时间上的差异,第5周的相应剂量的EGCG组精子畸形率低于第4周的检验结果。第5周检验的添加20mg/kg与40mg/kg剂量的EGCG抗CP诱导的作用较好与第4周的检验结果,差异显著。这可能是由于EGCG对于处在不同发育阶段的生殖细胞的敏感性有所不同。在该剂量下EGCG可能对精原细胞的中后期的作用优于对初级精母细胞,所以使第5周的检验结果好于第4周的检验结果。实验中各剂量的EGCG都没有产生明显的不良反应,这可以说明在此浓度范围内EGCG在体内是安全的。但是,在体外的一些研究显示,高浓度的EGCG反而会引发氧化作用。Spinaci等发现在对猪进行体外受精时用高浓度的EGCG(25nm/ml)孵育配子会减少受精卵数目。这可能是EGCG在体内和体外的作用可能有所差异。Higdon等认为EGCG等茶多酚类物质在体外能有效的减少活性氧簇,而在体内可能通过影响转录因子或者酶的活性来间接地发挥抗氧化剂的作用。本研究表明EGCG在实验浓度范围内本身不会诱发小鼠精子畸形,而且